Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Et mikrofysiologisk system for lægemiddelmakokinetisk og toksikologisk vurdering af tarmen/leversystemet

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Vi udsatte et mikrofysiologisk system (MPS) med tarm og leverorganoider for acetaminophen (APAP). I denne artikel beskrives metoderne til organoidproduktion og APAP-farmakoketiske og toksikologiske ejendomsvurderinger i mps.' en. Den beskriver også de vævsfunktionsanalyser, der er nødvendige for at validere resultaterne.

Abstract

De nyligt indførte mikrofysiologiske systemer (MPS), der dyrker humane organoider, forventes at klare sig bedre end dyr i den prækliniske testfase af lægemiddeludviklingsprocessen, fordi de er genetisk menneskelige og opsummerer samspillet mellem væv. I denne undersøgelse den menneskelige tarmbarriere (emuleret af en samkultur af Caco-2 og HT-29 celler) og leverækvivalenten (emuleret af sfæroider lavet af differentierede HepaRG-celler og humane levertenytceller) blev integreret i en mikrofluidisk anordning med to orgelchip (2-OC) til vurdering af nogle acetaminophofen (APAP) farmakologiske (PK) og toksikologiske egenskaber. MPS havde tre forsamlinger: Tarm kun 2-OC, Lever kun 2-OC, og tarm /lever 2-OC med de samme medier perfusing begge organoider. Til PK-vurderinger udførte vi APAP i medierne på forudindstillede tidspunkter efter administration af den enten over tarmbarrieren (efterligner den mundtlige rute) eller i medierne (efterligner den intravenøse rute) ved henholdsvis 12 μM og 2 μM. Medieprøverne blev analyseret ved omvendt fase højtryksvæskekromatografi (HPLC). Organoider blev analyseret for genekspression, for TEER værdier, for proteinudtryk og aktivitet, og derefter indsamlet, fast, og sendt til et sæt af morfologiske evalueringer. MTT-teknikken klarede sig godt ved vurderingen af organoidens levedygtighed, men analyserne med højt indhold (HCA) var i stand til at påvise meget tidlige toksiske hændelser som reaktion på APAP-behandling. Vi har kontrolleret, at mediestrømmen ikke i væsentlig grad påvirker APAP-absorptionen, mens det forbedrer leverens tilsvarende funktionalitet betydeligt. APAP menneskelige intestinal absorption og levermetabolisme kunne efterlignes i MPS. Forbindelsen mellem MPS-data og silicomodellering har et stort potentiale til at forbedre forudsigeligheden af in vitro-metoderne og give bedre nøjagtighed end dyremodeller i farmakokologiske og toksikologiske undersøgelser.

Introduction

På grund af genomiske og proteomiske forskelle har dyremodeller begrænset prædiktiv værdi for flere menneskelige resultater. Desuden er de tidskrævende, dyre og etisk tvivlsomme1. MPS er en forholdsvis ny teknologi, der har til formål at forbedre den prædiktive effekt og reducere omkostninger og tid brugt med prækliniske tests. De er mikrofluidiske anordninger, der dyrker organoider (kunstige mimetik funktionelle enheder af organer) under medieflow, der fremmer organoid-organoid kommunikation. Organoider fremstillet af humane celler øger den translationellerelevans 2,3,4. MPS forventes at klare sig bedre end dyreforsøgene, fordi de er genetisk menneskelige og opsummere samspillet mellem væv. Når den er fuldt funktionsdygtig, vil mps give mere meningsfulde resultater, ved højere hastighed og lavere omkostninger og risici4. Mange grupper er ved at udvikle MPS til flere formål, især sygdomsmodeller til test af lægemidlets effektivitet.

Eksponeringsniveau er en af de mest kritiske parametre til vurdering af lægemidlets effekt ogtoksicitet 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS tillader organoid integration, der emulerer systemisk eksponering og forventes at klare sig bedre end den traditionelle 2D humane væv kultur. Denne teknologi kan forbedre forudsigelsen af sammensat tarmabsorption og levermetabolisme4betydeligt.

En MPS integrere menneskelige ækvivalent model af tarm og lever er et godt udgangspunkt, i betragtning af den centrale rolle, som disse to organer i narkotika biotilgængelighed og systemiskeksponering 13,14,15. APAP er et attraktivt lægemiddel til at studere en MPS uden en nyre tilsvarende, fordi dens metabolisering sker primært af leveren16,17.

Den 2-OC er en to-kammer mikrofluidisk enhed egnet til kulturen i to forskellige humane ækvivalente væv / organoider forbundet med mikrokanaler16. For at efterligne en in vitro human oral/intravenøs administration af et lægemiddel og vurdere virkningerne af krydstale mellem tarmen og leverækvivalenter på APAP farmakokinetik, ud over organoidernes funktionalitet og levedygtighed blev der udført tre forskellige MPS-samlinger: 1) en "Tarm 2-OC MPS" bestående af en tarmækvivalent baseret i et kulturindsættelse, der indeholder en Caco-2 + HT-29-cellers cokultur, integreret i 2-OC-enheden; 2) en "Lever 2-OC MPS" bestående af lever sfæroider af HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) integreret i 2-OC enhed; og (3) en "Tarm/lever 2-OC MPS" bestående af tarmækvivalenten i det ene enhedsrum, der kommunikerer med leverækvivalenten i den anden af mediestrømmen gennem de mikrofluidiske kanaler.

Alle analyser blev udført under statiske (ingen flow) og dynamiske (med flow) forhold på grund af virkningen af den mekaniske stimuli (kompression, stretching, og forskydning) på cellens levedygtighed og funktionaliteter18,19,20. I denne artikel beskrives protokollen for APAP oral/intravenøs indhyling emulering og de respektive absorption / metabolisme og toksikologiske analyser i 2-OC MPS indeholder human tarm og lever ækvivalent modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion af vævsækvivalenter til dyrkning i 2-OL

  1. Produktion af tyndtarmens barriere
    1. Vedligehold Caco-2 og HT-29 celler ved hjælp af tarmen tilsvarende medium: DMEM suppleret med 10% FBS, 1% penicillin og streptomycin, og 1% ikke-essentielle aminosyrer, som er navngivet som "DMEM S" i dette manuskript.
    2. Fjern mediet, vask to gange med 1x DPBS og tilsæt 8 ml 0,25% Trypsin/EDTA for at adskille Caco-2 celler dyrket i cellekulturkolber (175 cm2). Inkuber i 5 minutter ved 37 °C og stop reaktionen ved at tilsætte mindst dobbeltvolumen trypsinhæmmeren. Der udføres den samme procedure for HT-29-celler, der justerer reagensvolumenerne, da en mindre mængde af disse celler er nødvendige, og de vedligeholdes i mindre kolber (75 cm2).
    3. Centrifuge ved 250 x g i 5 min. fjernes supernatanten fra begge rør, og cellepillerne opsprænkes igen i 10 ml DMEM S. Count-celler, hvilket sikrer en celleoverholdelse på over 80 %. Aseptisk integrere cellekultur skær i en 24-brønd plade tidligere fyldt med 400 μL DMEM S pr brønd i basolaterale side (som repræsenterer den menneskelige blodbanen).
    4. Saml Caco-2 og HT-29 celler i et forhold på 9:121. Brug 2,25 x 105 Caco-2 og 2,5 x 104 HT-29 celler til hver tarmækvivalent i et endeligt volumen på 200 μL DMEM S. Juster celletal og volumen i henhold til det ønskede antal organoider. Bland omhyggeligt.
    5. Pipette 200 μL celleopløsning i hver inserts apikale side (som repræsenterer den menneskelige tarmlummenside), såning af 250.000 celler pr. indsættelse. Samdyrke cellerne i skærne i tre uger22. Skift mediet mindst tre gange om ugen, aspirere det fra både apikale og basolaterale sider med en steril Pasteur pipette, idet pas på ikke at beskadige den intakte cellebarriere.
      BEMÆRK: Fortsæt med aspirationen på den apikale side for ikke at røre ved cellebarrieren (aspirere ved at støtte Pasteur-pipetten på celleindsatsens plastkant).
    6. Kontroller den stramme monolagdannelse ved at måle TEER (transepithelial elektrisk modstand) hver tredje dag ved hjælp af et voltmeter23i henhold til producentens anvisninger.
      1. Udfør en tom, måle modstanden på tværs af en celle kultur indsætte uden celler, men med samme celle medium og på samme celleplade.
      2. Vævsmodstand beregnes ved at trække blindmodstanden fra vævsækvivalentmodstanden og formere sig med filtermembranens effektive overfladeareal (0,6 cm2). En god tarmbarriereresistens er i en rækkevidde på 150 til 400 Ω∙cm2.
        BEMÆRK: Efter 21 dage skal cellerne være helt differentierede og tarmbarrieren dannes, så tarmækvivalenterne er klar til at blive integreret i MPS.
  2. Produktion af leverækvivalenter
    1. Vedligehold HepaRG-celler ved hjælp af leverækvivalentsmediet, som er William's Medium E suppleret med 10% føtalt kvægserum, 2 mM L-glutamin, 100 enheder/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 5 μg/ml human insulin og 5 x 10-5 M hydrocortison, og hedder "Williams E S" i dette manuskript. Forny HepaRG medier hver 2-3 dage og vedligeholde cellekultur i to uger for at indlede differentiering i hepatocytter og cholangiocytter.
    2. Efter de første to uger, tilføje 2% DMSO til HepaRG's medium i yderligere to uger for at fuldføre celle differentiering24,25. Dyrk HHSTeC i Stellate Cell Media (SteC CM), ved hjælp af poly-L-lysin-belagt cellekultur kolber, skiftende medier hver anden eller tredje dag.
    3. Fjern mediet, vask to gange med 1x DPBS og tilsæt 8 ml 0,05% Trypsin/EDTA, for at adskille HepaRG celler dyrket i cellekultur kolber (175 cm2). Inkuber i 5 til 10 minutter ved 37 °C og stop reaktionen ved at tilsætte mindst dobbelt så stor mængden af trypsinhæmmer. Udføre det samme for HHSTeC, tilpasse reagens volumen, da en mindre mængde af disse celler er nødvendige, og de kan opretholdes i mindre kolber (75 cm2).
    4. Centrifuge både ved 250 x g i 5 min. fjernes supernatanten og cellerepillerne op igen i Williams E S-mediet. Tæl celler, der sikrer en celle levedygtighed højere end 80%.
    5. Generer lever sfæroider kombinere HepaRG og HHSTeC celler i et forhold på 24:1, henholdsvis i Williams E S medium16. Der tilsættes 4,8 x 104 differentierede HepaRG og 0,2 x 104 HHSTeC for at sammensætte hver lever sfæroide på 50.000 celler i et volumen på 80 μL. Juster cellenumre og volumen i henhold til det ønskede antal sfæroider. Bland omhyggeligt.
    6. Ved hjælp af en multikanalpipette skal du dispensere 80 μL af den kombinerede cellepulje i hver brønd på 384 sfæroide mikroplader, som har rund brøndbundsgeometri.
      BEMÆRK: Efter fire dage dannes der sfæroider på ca. 300 μm.
    7. Ved hjælp af wide-bore tips, overføre leveren sfæroider til ultra-lav-vedhæftet fil 6 godt plader, som tillader den nødvendige "en efter en" optælling.

2. Integration af tarm og leverækvivalenter i en 2-OC MPS

  1. Tarm 2-OC MPS samling for absorption assay
    1. Pipette 500 μL DMEM S i det større rum på 2-OC og 300 μL i den mindre. Aspirere basolaterale og apikale medier af hver tarmbarriere ækvivalent i de 24 brøndplader. Brug sterile kraftafføringer til at integrere et skær pr. 2-OC kredsløb, specielt i det større rum. Påfør 200 μL af tarmmediet på den apikale side.
      BEMÆRK: Undgå dannelsen af bobler, når du integrerer organoiderne i MPS.
    2. Tilslut mps'en til styreenheden, som skal tilsluttes en lufttilførsel under tryk. Indstille parametrene: et tryk på ca. ± 300 bar og en pumpefrekvens på 0,3 Hz. Start strømmen 24 timer før teststoffets indgift. Den næste dag, udføre APAP behandling.
  2. Lever 2-OC MPS samling for metabolisme assay
    1. Pipette 650 μL Williams E S ind i det store rum og 350 μL i det mindre rum, som vil modtage sfæroiderne. I de ultra-lav-vedhæftede 6 brøndplader, tælle sfæroider ved hjælp af wide-bore tips. Hver leverækvivalent består af tyve sfæroider26. Integrer tyve leverækvivalenter pr. kredsløb ved hjælp af brede spidser, som kun tillader overførsel af organoider, ind i det mindre rum i en 2-OC.
    2. Tilslut mps'en til styreenheden, som skal tilsluttes en lufttilførsel under tryk. Indstille parametrene: et tryk på ca. ± 300 bar og en pumpefrekvens på 0,3 Hz. Start strømmen 24 timer før teststoffets indgift. Den næste dag, udføre APAP behandling.
  3. Tarm/lever 2-OC MPS samling for absorption og metabolisme assay
    1. Kombiner de to medier (tarm og lever) i en 1:4 andel, hvilket betyder 200 μL DMEM S i tarmen apikale side og 800 μL af Williams E S i basolateral side. Integrer tarm og lever ækvivalenter, samtidig, i 2-OC.
    2. Tilslut mps'en til styreenheden, som skal tilsluttes en lufttilførsel under tryk. Indstille parametrene: et tryk på ca. ± 300 bar og en pumpefrekvens på 0,3 Hz. Start strømmen 24 timer før teststoffets indgift. Den næste dag, udføre APAP behandling.
      BEMÆRK: For alle forsøg udføres hvert tidspunkt i tre eksemplarer, hvilket betyder tre adskilte 2-OC kredsløb (dvs. 1 og 1/2 2-OC-enheder). Det samlede volumen af hver 2-OC kredsløb er 1 ml.

3. Præparatet af Acetaminophen (APAP)

  1. Forbered APAP-lageropløsningen, der opløser APAP i absolut ethanol. På forsøgsdagen fortyndes APAP i det pågældende medium (APAP-opløsning) til en koncentration på 12 μM til "oral administration" og 2 μM til "intravenøs administration".
  2. Sørg for, at den endelige koncentration af ethanol i køretøjets kontrol- og behandlingsopløsning er 0,5 % for begge administrationer. For den positive kontrol (100 mM APAP) er ethanolkoncentrationen 2%.

4. Indgift af teststoffer og medieprøvetagning

  1. APAP "mundtlig" administration og medier prøveudtagning
    1. Aspirere basolaterale og apikale medier for hver tarmbarriereækvivalent i 2-OC. Pipette 500 μL af det relevante kulturmedium ind i det store rum ved organoid basolateralsiden og 300 μL i det lille rum.
    2. Kontroller for bobler og fortsæt med tarmbarrieren svarende behandling med teststoffet i den apikale side, efterligne oral administration. Emulere APAP "oral" administration ved at tilføje 200 μL af en 12 μM APAP opløsning på den apikale side af tarmkultur skær, som repræsenterer tarmen "lumen side" (Figur 1B). Tilslut hovedplanen til styreenheden.
    3. Opsaml det samlede volumen fra apikale og fra basolaterale sider på følgende tidspunkter: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h og 24 h15,27. Udfør alle eksperimenter i tre eksemplarer, ved statiske og dynamiske forhold, og opsaml hver prøve af hvert tre eksemplarer i en separat mikrorør. Analysér prøverne ved hjælp af HPLC/UV.
      BEMÆRK: Separate apikale og basolaterale prøver.
  2. APAP "intravenøs" administration og medier prøveudtagning
    1. Emuler den "intravenøse" rute ved at administrere 2 μM APAP-opløsning direkte ind i leverrummet. Aspirate alle 2-OC medium indhold. Pipette 650 μL Williams E S indeholdende teststoffet i det store rum og 350 μL af samme medie i det mindre rum, som indeholder de 20 sfæroider. Opsaml alle bind på følgende tidspunkter: 0 h, 30 min, 1 time, 2 timer, 3 timer, 6 timer, 12 timer og 24 h27,28.
    2. Udfør alle eksperimenter under tre eksemplarer under statiske og dynamiske forhold. Hver prøve, af hvert tre eksemplarer, indsamles i en separat mikrorør. Analysér prøverne ved hjælp af HPLC/UV.

5. Instrumentering og kromatografiske forhold

  1. HPLC-analyse
    1. Angiv alle relevante parametre for HPLC-analysen i henhold til tabel 1.
    2. Den mobile fase filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter under vakuum. Prøverne filtreres gennem et PVDF-sprøjtefilter af en PVDF-sprøjtestørrelse på 0,22 μm (diameter 13 mm), og de opbevares i et hætteglas. Start målingen.
  2. Stock-løsninger, kalibreringsstandarder og kvalitetskontrolprøver (QC)
    1. Der forbered 10 mM APAP-stamopløsninger i ammoniumacetatbuffer (100 mM, pH 6,8) og fortyndes yderligere med DMEM S og Williams E S cellekulturmedier fortyndet med ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v) for at opnå arbejdsopløsningerne fra 0,25 til 100,00 μM.
    2. Medtag et sæt kalibreringsprøver i tre eksemplarer samt kvalitetskontrolprøver på fire niveauer i tre eksemplarer. Forbered disse standarder ved serl fortynding.
    3. Opret kalibreringskurver af APAP-topområder i forhold til APAP nominelle standardkoncentrationer. Bestem den lineære regressionsform for hver kalibreringskurve. Vurder de forskellige kalibreringsmodellers godhed ved visuel inspektion, korrelationskoefficient, intra- og interløbsnøjagtighed og præcisionsværdier.
    4. Indsprøjte blanke prøver af DMEM S og Williams E S-medier fortyndet i ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v) i sextuplicat. Der fortyndes tre eksemplarer af kvalitetskontrolprøverne i DMEM S- og Williams E S-medier, der fortyndes med ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v), for APAP-koncentrationerne på 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 og 90,00 μM.
    5. Sørg for, at kvalitetskontrolprøverne fremstilles ud fra en ny lageropløsning, der er forskellig fra den, der anvendes til at generere en standardkurve. Brug kvalitetskontrolprøver til at undersøge variationer inden for og mellem kørende.
  3. Valideringsprocedurer
    1. Den bioanalytiske metodevalidering udføres efter de tidligere rapporteredeprocedurer 29,30. Udfør de kromatografiske kørsler på fem eller seks separate lejligheder, overvejer Williams E S og DMEM S cellekultur medier, henholdsvis.
    2. Sørg for, at kalibreringspunkter fra 0,25 til 100,00 μM APAP, i DMEM S eller Williams E S-cellekulturmedier fortyndet i ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v), afbildes på grundlag af topområderne i APAP (akse y) i forhold til de respektive nominelle koncentrationer (akse x). Sammenlign skråningerne af disse standardkalibreringskurver med skråninger af kalibreringskurve fremstillet i ammoniumacetatbuffer. Sørg for, at alle kalibreringskurver har en korrelationsværdi på mindst 0,998.
    3. Bestemme præcision og nøjagtighed (intra og inter-run) for analysand i surrogat matrix ved hjælp af replikater på fire forskellige niveauer LLOQ, lav, midterste og høj kvalitet kontrol på fem eller seks forskellige dage. Der foretages intra-run præcisions- og nøjagtighedsmålinger samme dag i DMEM S- eller Williams E S-cellekulturmedier, der fortyndes i ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v), og som indeholder 0,50, 4,50, 45,00 og 90,00 μM APAP-koncentrationer (n= 3).
    4. Hvert sæt kvalitetskontrolprøver, der indeholder APAP-koncentrationerne fra nyligt opnåede kalibreringskurver, skal evalueres. Analyse analysernes selektivitet testes ved graden af adskillelse af rentestoffet og mulige andre kromatografiske toppe forårsaget af forstyrrende komponenter.
  4. Nedre kvantificeringsgrænse (LLOQ) og detektionsgrænsen (LOD)
    1. Den nedre kvantificeringsgrænse (LLOQ) bestemmes på grundlag af standardsafvigelsen for responsen og hældningstilgangen. Formlen 10α/S beregnes ved hjælp af formlen 10α/S, hvor α er standardafvigelsen for y-skæringspunkt, og S er hældningen af lige linje opnået ved at afbilde kalibreringskurver29,30. Estimer detektionsgrænsen (LOD) under hensyntagen til 3,3 gange standardafvigelsen for blindprøven divideret med kalibreringskurvenshældning 29,30.

6. Vævsækvivalenter levedygtighed / funktionalitet

  1. Mtt
    1. Udfør en MTT-analyse for at vurdere organoids levedygtighed på alle tidspunkter i MPS-analysen. Som den negative kontrol skal du bruge cellemedier plus køretøj. Som positiv kontrol behandles organoiderne med 100 mM APAP og 1% NaOH fortyndet i cellemedium.
    2. Overfør de 20 sfæroider af hver replikat for individuelle brønde i en 96 brøndplade, og cellekulturen indsætter, der indeholder tarmækvivalenter, til 24 brøndcelleplader, hvilket placerer en tarmækvivalent pr. brønd. Vask vævsækvivalenterne tre gange med 1x DPBS.
    3. Der tilsættes 300 μL 1 mg/ml MTT-opløsning, fortyndet i det pågældende cellemedium pr. brønd. Inkuber pladerne i 3 timer ved standardcellekulturforhold.
    4. Fjern MTT-opløsningen fra hver brønd omhyggeligt ved pipettering. Ekstrakt MTT formazan fra tarmen og leverækvivalenter ved hjælp af 200 μL isopropanol pr. brønd natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Luk låget for at forhindre fordampning.
    5. Overfør 200 μL af hver supernatant til den respektive fordefinerede brønd i en 96 brøndmikrotestplade. Brug isopropanol som tom.
    6. Læs formazan absorbans i en pladelæser ved 570 nm. Beregn cellernes relative evne til at reducere MTT (%) anvendelse af den gennemsnitlige optiske massetæthed for hvert tidspunkt sammenlignet med den negative kontrol, der betragtes som 100 % celleforbrugs levedygtighed.
  2. Cytokemi/Histologi
    1. Fastgør tarm- og leverækvivalenter i 25 min ved stuetemperatur ved hjælp af 4% (w/v) paraformaldehyd i 0,1 M fosfat-saltvandsbuffer, pH 7,4. Organoiderne vaskes 5 gange i PBS-bufferen i 10 minutter hver gang. Plet tarmen og leveren ækvivalenter med tetramethylrhodamine isothiocyanate-phalloidin eller Alexa Fluor 647 falloidin, 1:50 i PBS31.
    2. Overfør dem til OCT frysende medium i et par minutter til akklimatisere på RT, før du overfører dem til flydende kvælstof, indtil den komplette frysning. Udfør lever sfæroider kryosektioner omkring 10-12 μm tyk, ved hjælp af en kryostat.
    3. Monter vævssektionerne i monteringsmediet med DAPI. Undersøg dem ved konfokal fluorescensmikroskopi.
    4. Frys organoiderne efter fiksering for at udføre hæmatoxylin og eosinfarvning i henhold til de etablerede protokoller. Monter objektglassene med monteringsmedium efter udskæring af vævet som beskrevet ovenfor, og tag histologiske billeder ved hjælp af et optisk mikroskop.
  3. Analyse af højt indhold
    1. Mitokondrielle og nukleare farvning af cellerne
      1. Rekonstituere det frysetørrede pulver i DMSO for at lave en 1 mM mitokondriel farvningsop lageropløsning (f.eks. Opbevar aliquoteret lageropløsning ved -20 °C beskyttet mod lys. Den 1 mM mitokondrielle pletopløsning fortyndes til den endelige koncentration (200 nM) i præwarmed (37 °C) vævskulturmedium uden serum.
      2. Fjern cellekulturmediet. Den mitokondrielle farvningsopløsning til helt at dække prøven og inkubere cellerne i 15-45 min. ved 37 °C i befugtet atmosfære med 5 % CO2.
      3. Fjern forsigtigt mitokondriel farvningsopløsning og udskift den med 2-4% paraformaldehyd fiksativ i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
      4. Skyl de faste celler forsigtigt med PBS i 5 minutter. Gentag vaskeprocessen to gange.
      5. Der tilberedes en opløsning af en nukleinopløsning på 10 mg/ml (16,23 M) ved at opløse 100 mg Hoechst 33342 farvestof i 10 ml ultrarent vand.
        BEMÆRK: Lageropløsningen skal aliquoteres og opbevares beskyttet mod lys ved -20 °C.
      6. Der klargøres en 0,2-2,0 μg/ml nukleinsyreopløsning i PBS, og de fikserede celler inkuberes med nukleinsyrefarvningsopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur.
      7. Fjern den nukleinsyrefarvning, der virker, og skyl cellerne forsigtigt med PBS i 5 minutter tre gange. Cellerne skal opbevares i PBS ved 4 °C, beskyttet mod lys.
    2. Mitokondrielle og nukleare farvning analyse
      1. Analysér celler ved hjælp af et fluorescensmikroskop med filtersæt, der passer til nukleinsyrepletten (λEx/ λEm: 361/497 nm) og mitokondriel plet (λEx/ Emλ: 644/665 nm). Find celler ved nukleinsyre positiv farvning og kvantificere cellenummer. Kvantificer mitokondriel pletfluorescensintensitet i mitokondrier.
  4. Morfometriske målinger (beregninger af sfoider) i ImageJ
    1. Eksporter HCA-billeder (High Content Analysis) som *.flex-filer fra Columbus-softwaren. Importer .flex-filer som en gråtoneskala i ImageJ ved hjælp af Bio-Formater plugin32: Filer > Import > Bioformater.
    2. Vælg Hyperstack-visning i vinduet Importindstillinger, og aktivér opdel kanaler under Opdel i separate vinduer. Denne indstilling giver adgang til alle filer i en bestemt kanal (f.eks. Vælg ikke Brug virtuel stak under Hukommelsesstyring.
      BEMÆRK: Det er at foretrække at bruge DAPI-kanalen som "støv" i billeder, da kulturmediet reduceres i UV-bølgelængde (f.eks. 405 nm).
    3. Juster pixelstørrelse (Analysér > Angiv skalering), hvis den ikke er indlæst i henhold til integrerede værdier i .flex-filen. Påfør et Gaussisk sløringsfilter for at fjerne det overskydende støjniveau og undgå uregelmæssigheder i formkontur. Proces > Filtre > Gaussisk sløring. En høj værdi af Sigma (radius) mellem 2,0 og 3,0 er ideel til de fleste tilfælde. Hvis stakken har flere billeder, skal du anvende dem alle (vælg Vinduet Ja i processtak).
    4. Generér et binært billede for at adskille baggrunds- og organoider (objekter) ved hjælp af en tærskel. Klik på Billede > Juster > Tærskelværdi. Brug den røde maske til at justere værdierne i henhold til billedets intensitet, så den passer til organoidformen, så morfologien forbliver intakt. Deaktiver mørk baggrund, hvis billedet har en hvid baggrund. Klik på Anvend.
    5. Vælg metoden Tærskel i vinduet Konverter stak til Binær. Normalt foretrækkes Standard eller Trekant i denne type billedbehandling. Hold baggrunden som mørk. Vælg Beregn tærskel for hvert billede, hvis der er flere billeder i stakken.
    6. Vælg Proces > Binær > Udfyldningshuller. Du kan eventuelt fjerne huller fra baggrunden. I Proces > Binær > Indstillings, skal du vælge Sort baggrund og udføre Fyld huller igen. Deaktiver indstillingen Sort baggrund, før du fortsætter til næste trin.
    7. Separate objekter. For organoider er vandskelmetoden et godt valg. Klik på Proces > Binær > Watershed. Udfør figuranalysen.
      1. Vælg Analysér > Angiv målinger. Flere muligheder er tilgængelige (detaljer i https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). I organoider skal du vælge Område, Middelgråværdi, Min og maks. Du kan også vælge Vis etiket for at identificere objekter i billedet og Videnskabelig notation. Klik på OK.
      2. Vælg Analyse > Analyser partikler. Vælg grænserne for størrelse og cirkularitet. Hold henholdsvis 0-uendelighed og 0,00-1,00 for at måle alle objekter i billedet. Vælg Kontureri Vis , så objekterne identificeres. Aktiver visningsresultater for outputresultater. Udeluk på kanter for at udelade objekter, der rører kanter. Medtag huller, så eventuelle indvendige huller i objekterne betragtes som en del af hovedformen.
    8. Gentag figuranalyse for hver billedstak, og resultaterne tilføjes i en enkelt tabel. Eksportér resultattabel i fil > Gem som... som kommaseparerede værdier (.csv) fil.
  5. PCR i realtid
    1. Ekstrakt RNA fra vævsækvivalenter ved hjælp af en monofasisk opløsning af phenol og guanidin isothiocyanat efter producentens anvisninger.
    2. CDNA-syntesen udføres ved omvendt transskription af 1 – 2 μg total RNA.
    3. Forstærke alle mål ved hjælp af genspecifikke primere (tabel 5) til at udføre kvantitativ PCR i realtid. Hver qRT-PCR indeholder 30 ng omvendt transskriberet RNA og 100 nM af hver primer.
    4. Følg PCR betingelser: 50 °C i 3 minutter (1 cyklus); 95 °C i 5 minutter (1 cyklus) 95 °C i 30 sekunder, 59 °C i 45 sekunder og 72 °C i 45 sekunder (35 - 40 cyklusser).
  6. CYP-analyse
    1. Følg afsnit 2.2 for lever 2-OC samling. Forsøgsgrupperne er no-celle kontrol, APAP 2 μM behandlinger for 12 timer, 24 timer og køretøjskontrol. Følg punkt 3.3 og 4.2 for APAP 2 μM forberedelse og behandling.
      BEMÆRK: For at sikre, at alle prøverne er klar på samme tid til CYP-analyse, skal du starte 12 timers behandlingen 12 timer efter, at 24 timers behandlingen er startet. Behandl ikke-cellestyring af CYP-aktivitet med 0,5 % ethanolopløsning samt køretøjets kontrol.
    2. Tø 3 mM luminogen substrat stamtælgeopløsning ved stuetemperatur og lav en 1:1000 fortynding i William's E S. Beskyt mod lys.
    3. Saml sfæroider og overføre hver eksperimentel gruppe til en brønd af en 96-brønd plade. Mediet fjernes, vaskes to gange med 100 μL 1x DPBS og der tilsættes 80 μL 3 μM substratopløsning pr. brønd. Hold no-celle kontrol i William's E S medium. Gem en brønd uden sfæroider eller substrat opløsning til en baggrundskontrol. Inkuberes i 30-60 min ved 37 °C med 5% CO2, beskyttet mod lys.
    4. Equilibrate lyophilized Luciferin Detection Reagens (LDR) ved hjælp af Reconstitution Buffer med esterase. Bland ved at hvirvle eller invertere. Den passende lydstyrke opbevares ved stuetemperatur indtil næste trin.
      BEMÆRK: Rekonstitueret LDR kan opbevares ved stuetemperatur i 24 timer eller ved 4 °C i 1 uge uden aktivitetstab. Til langtidsopbevaring opbevares ved -20 °C.
    5. 25 μL intakt spheroids supernatant overføres i tre forskellige brønde af en hvid uigennemsigtig 96-brønd mikroplade efter inkubation. Der tilsættes 25 μL LDR pr. brønd og homogeniseres.
    6. Inkuber den hvide plade ved stuetemperatur i 20 minutter. Læs luminescensen på et luminometer. Brug ikke et fluorometer.
    7. Nettosignaler beregnes ved at trække baggrunds luminescensværdier (ingen cellekontrol) fra testforbindelserne og de ubehandlede (køretøjskontrolværdier). Der beregnes procentvis ændring af CYP3A4-aktivitet ved at dividere de ubehandlede nettoværdier med de ubehandlede nettoværdier og multiplicere med 100.
  7. Vestlige blotting
    1. Overfør lever sfæroiderne til en identificeret 1,5 ml mikrorør. Mediet fjernes og vaskes to gange med 100 μL 1x DPBS.
    2. Lyser lever sfæroiderne i 100 μL cellelyse ripa buffer ved 4 °C i 20 min. Centrifuge i 15 min, 4 °C og 11000 omdr./min. Overfør supernatanten til en anden identificeret 1,5 ml mikrorør.
    3. Kvantificer den mængde protein, der opnås ved Bradford-metoden. Der indlæses mellem 10 og 50 μg protein fra det kvantificerede cellelysat pr. brønd af en gradientpolyakrylamidgel 3-15% og udfører en SDS-SIDE.
    4. Overfør det belastede protein fra gelen til en 0,22 μm PVDF-membran gennem det halvtørre systemudstyr. Brug en overføringsopløsning på 50 mM Tris-HCl og 192 mM glycin. Angiv udstyrsparametre i henhold til antallet af geler, der skal overføres (1 til 2 ad gangen).
    5. Der blokeres for uspecifikke interaktioner på PVDF-membran med en 3-5% skummetmælksopløsning i TBS-T-buffer: Tris-Buffered Saltvand (50 mM Tris pH 7,6, 150 mM natriumchlorid) suppleret med 0,1% af Tween 20. Hold membranen under forsigtigt konstant omrystning i 1 time ved stuetemperatur.
    6. Vask med TBS-T under forsigtigt konstant omrystning i 3-5 min ved stuetemperatur. Gentag dette vasketrin to gange.
    7. Fortyndes albumin og vinculin primære antistoffer til henholdsvis 1:1000 og 1:2000 på TBS-T. Membranen inkuberes med primære antistoffer natten over ved 4 °C under forsigtigt konstant omrystning.
      BEMÆRK: Følg altid producentens anvisninger for at fortynde antistoffer.
    8. Det primære antistof fjernes og vaskes membran 3 gange (trin 6.7.6). Fortyndet ECL anti-mus IgG sekundært antistof til 1:5000 på TBS-T. Membranen inkuberes med et sekundært antistof under let konstant omrystning i 2 timer ved stuetemperatur.
    9. Det sekundære antistof fjernes, og membranen vaskes (trin 6.7.6). Udfør proteindetektion ved hjælp af ECL Western Blotting Substrate. Eksponere autoradiografiske film i 30 s til 30 min. Udfør immunblottingdetektionen i tre eksemplarer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at udføre PK APAP test i 2-OC MPS, det første skridt er at fremstille den menneskelige tarm og lever ækvivalenter (organoids). De er integreret i 2-OC microfluidic enhed (Figur 1A) 24 h før start af PK APAP assay. Den næste dag ændres mediet, og modellen udsættes for APAP. Figur 1 illustrerer tarmen og leverækvivalenter placeret inde i 2-OC-enheden (Figur 1B) og APAP PK-forsøgstidskursen (Figur 1C). Vi udførte en MTT-analyse, TEER-målinger, HCA, pcr i realtid, vestlig blotting, histologi og konfokal fluorescensmikroskopi i 2D-kultur og 3D-organoider for at kontrollere vævets levedygtighed og opdage mulige APAP-toksiske virkninger. I de konfokale fluorescensmikroskopibilleder blev de tarmækvivalenter, der var besympet med DAPI og Phalloidin (for henholdsvis kerner og actin), præsenteret som en sammenhængende barriere for de ikke-behandlede (figur 2A) og de 12 μM APAP-behandlede prøver (figur 2B). Som det fremgår af figur 2C,viste MTT-analysen relative cellelevedyrsniveauer over 70 %, hvilket indikerer, at der ikke forekom relevante cytotoksiske virkninger som reaktion på APAP-eksponering ved 12 μM-koncentration33,34,35,36,37. Den positive kontrol (100 mM) inducerede signifikant celledød (overlevelse under 5%). Caco-2/HT-29 levedygtighed og korrekt differentiering samt tarmen tilsvarende barriere integritet blev kontrolleret af TEER evolution i differentiering periode (Figur 2D). APAP forvoldede ikke nogen ændring i TEER-værdierne som vist i figur 2E. Udtrykket af de aktive natrium-koblede glukose transportører SLC5A1, multidrug modstand transporter MDR1 og natrium-kalium ATPase blev analyseret, for at kontrollere APAP behandling indvirkning over cellebarrierer dannelse og basal funktionalitet. Som påvist i figur 2F-Hhar både ikke-behandlede og APAP-behandlede tarmækvivalenter vist et lignende udtryk for SLC5A1 og NaKATPase. Den orale administration af 12 μM APAP induceret markerede en stigning i MDR1 mRNA niveauer i tarme ækvivalenter efter 24 h (Figur 2H). Vi udførte også HCA af celle fænotopypiske ændringer ved en fluorophore farveblanding for kerner og mitokondriel masseindhold. Positive kontroller var 100 mM APAP og 1% NaOH.

Derudover analyserede vi, om 12 μM APAP kunne fremkalde cytotoksicitet til 2D Caco-2/HT-29 co-kultur. De tarmceller billeder erhvervet med fluorescensmikroskopi vist i figur 2I bekræfter MTT-data, som har vist, at 12 μM APAP ikke forårsagede signifikant cytotoksicitet i Caco-2/HT-29 tarmækvivalenter.

Vurderingen af lever sfæroider basal levedygtighed og cytotoksicitet som reaktion på 2 μM APAP blev udført ved MTT assay og morfologiske analyser ved konfokal fluorescens mikroskopi, H & E histologi, og HCA assays. Som vist i figur 3Avar MTT-analysen ikke i stand til at identificere nogen relevant cytotoksicitet som reaktion på 2 μm APA-behandlingen i prøver taget fra lever 2-OC-samlingen under både statiske og dynamiske forhold. Cellernes levedygtighed faldt , men forblev på over 80 % i både 12 timer og 24 timer33,34,35,36,37. De positive kontrolbehandlinger (100 mM APAP og 1% NaOH) inducerede betydelige vævsskader (levedygtighed under 10%). Mikroskopiske konfokale billeder indikerer fraværet af et nekrotisk center i lever sfæroiderne i både basale eller APAP behandlingsbetingelser, og ingen tegn på signifikant dødelighed (Figur 3B-C). Men når vi analyserede flere cellulære fænocypiske ændringer efter køretøjet eller 2 μM APAP administration i 2D HepaRG/HHSteC coculture gennem HCA assay, ved hjælp af 100 mM APAP (C+) som en positiv kontrol, i modstrid med resultaterne af MTT-analysen, viste levercellerne tidlige cytotoksiske reaktioner på 2 μM APAP behandling (Figur 3D). Efter 24 timer var der et fald i antallet af celler i det nukleare område og en stigning i mitokondriel masse. Derudover blev en fluorophore farvemospisk cocktail indeholdende Hoechst 33342 og MitoTracker Deep Red brugt til at plette 3D-lever sfæroider (Figur 3J). Fiji software blev brugt til at evaluere 3D sfærisk arkitektur homogenitet blandt flere sfæroider (Figur 3E-I). Grafikken vist i figur 3E viser ligheden mellem lever sfæroider samlede areal. Højde-bredde-forholdet( figur 3F) omkring 1 betyder en mangel på bias under konfektureprocessen af sfæroiderne. Evalueringen viste også, at størstedelen af sfæroiderne var nogenlunde afrundede (figur 3G). Evalueringen af morfologi perimeter og cellefordeling blev udført ved cirkularitet (figur 3I) og ved soliditetsberegning (figur 3H). Vi konkluderede, at metoden til konfekture leveren sfæroider havde genereret organoider med en glat omkreds, kompatibel med sfærisk vækst, ingen bias, eller nekrose under processen.

Som påvist i figur 4A-Bviste lever sfæroiderne henholdsvis et relativt basalt højt niveau af albumin og GST mRNA-udtryk, hvilket indikerer korrekt basal funktionalitet. Ikke desto mindre, 2 μM APAP behandling for 24 h induceret et fald i albumin og GST mRNA ekspressionsniveauer, hvilket tyder på forringelse af lever sfæroider funktionelt på 24 h tidspunkt for APAP behandling.

Påvisning af CYP3A4- og UGT1A1 mRNA-ekspressionsniveauerne viser leverækvivalenter metabolisk kapacitet. CYP3A4 mRNA-basalniveauet (Figur 4C) var i overensstemmelse med tidligere rapporter6. APAP-behandlingen fremkaldte en tendens til et fald i både CYP3A4 mRNA- og UGT1A1-ekspressionen som reaktion på APAP-behandling (Figur 4C-D) endnu en gang, hvilket underbyggede hypotesen om svækkelse af lever sfæroider funktionelt ved 24-timers tidspunktet for APAP-behandling.

Derudover blev der udført eksperimenter med vestlig blotting og in vitro enzymatisk aktivitet for at analysere albuminproteinudtrykket samt CYP 3A4-aktiviteten i leverækvivalenter ved basal og ved APAP-behandlingsbetingelser. Vi fandt, at 2 μM APAP behandling udført på Liver 2-OC MPS, induceret en reduktion i leveren tilsvarende samlede albumin udtryk på 12 h og 24 h tid-point på både statisk (Figur 4E) og dynamisk (Figur 4F) betingelser. På den anden side viste leverækvivalenter prøver fra dynamiske forhold en tendens til at præsentere højere niveauer af protein udtryk for albumin i forhold til de statiske forhold (Figur 4G). CYP 3A4 in vitro-assay udført ved leverækvivalenter fra lever 2-OC MPS viste, at 2 μM APAP-behandling i 12 timer eller 24 timer var i stand til at fremkalde en robust og signifikant forringelse af CYP 3A4-aktivitet ved både statiske og dynamiske forhold (Figur 4H-I). Mere interessant, tilstedeværelsen af medier flow (dynamisk) har induceret en betydelig forbedring af leverækvivalenter CYP 3A4 aktivitetsniveauer i forhold til betingelser, hvor leveren ækvivalenter blev holdt i mangel af cirkulerende medium (statiske betingelser) (Figur 4J).

For at finde den mest følsomme analysebetingelse vedrørende HPLC-analyse blev flere parametre undersøgt, herunder sammensætningen af den mobile fase, typen og koncentrationen af tilsætningsstoffer. Det blev konstateret, at acetonitrile gav bedre kromatogram opløsning og passende retention tid end methanol. Hurtig og reproducerbar adskillelse af APAP blev opnået ved hjælp af en C18 omvendt fase kolonne. Værdien for APAP-retentionstiden (Rt) var 9,27 ± 0,19 minutter. Selektivitet for APAP er angivet ved formen og symmetrisk opløsning af toppen, samt ved manglen på forstyrrende toppe fra DMEM og Williams cellekultur medier.

APAP-standardkoncentrationerne i DMEM S og Williams E S-cellekulturmedier, der er fortyndet med ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v) fra 0,25 til 100,00 μM, blev anvendt til at opbygge kalibreringskurverne. Metodens linearitet blev bestemt ved ni koncentrationsniveauer. Dataene er vist i tabel 2 og tabel 3. Forholdet mellem APAP-koncentrationen og topområderne blev beskrevet ved lineære regressionsligninger: y = 16106*x + 3579,8 (R2=1, i DMEM medium) og y = 16397*x + 2475,1 (R2=1, i Williams medium), hvor "x" er APAP nominel koncentration i μM og "y" er chromatogram peak område af APAP i AU. Ved den øvre kvantificeringsgrænse (dvs. 100,00 μM) var den procentvise afvigelse og de interløbsvariationsværdier mindre end 2,50 %. Nøjagtigheden og præcisionen for ni koncentrationsniveauer, bortset fra 0,50 μM (LLOQ), var inden for et acceptabelt interval med DEV- og C.V. værdier på under 7,00 %(tabel 2 og tabel 3).

Den analytiske metode inter- og intra-run nøjagtighed og præcision, ved fire testede koncentrationer, faldt inden for de almindeligt accepterede kriterier for bioanalytiske analyser. Metodens reproducerbarhed blev evalueret ved at analysere replikater af APAP-kvalitetskontrolprøver på 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 og 90,00 μM. De intra-run og inter-run gennemsnitlige resultater er rapporteret i tabel 4. Analysens nøjagtighed og præcision demonstreres ved udviklingsværdier ≤ 15,00% og ved C.V. værdier ≤ 7,00%.

LOD blev bestemt som den prøve, hvis signal-støj-forhold (S/N) var lige større end 3 og svarede til en 0,25 μM APAP. På den anden side viste LLOQ, der anslås med 0,50 μM APAP-prøver, S/N-forholdet svarende til 10. Desuden fandt vi nøjagtighedsværdier (DEV%) inden for ≤ 19,00% af de nominelle koncentrationsværdier. Intra- og interløbsvariationerne blev påvist af C.V. ≤ 18,77%, som vist i tabel 2, tabel 3 og tabel 4)29,30.

APAP PK-analyserne blev udført i tre forskellige 2-OC MPS-samlinger: 1) Tarm 2-OC, der kun indeholdt tarmækvivalenten; 2) Lever 2-OC, indeholder lever sfæroider kun og 3) Tarm/lever 2-OC med både tarmbarriere og lever sfæroider.

I absorptionsundersøgelser blev den orale rute efterlignet af administrationen af 12 μM APAP på tarmen ækvivalent apikale side. APAP-koncentrationerne blev målt ved HPLC/UV i mellemprøverne, indsamlet fra apaliske og basolaterale tarmækvivalenter sider, i både statiske og dynamiske forhold. APAP kinetik i mediet indsamlet fra apikale og basolaterale sider viste, at tarmen model var i stand til at absorbere APAP. Der var et progressivt APAP-koncentrationsfald i den apikale side (figur 5A) samtidig med APAP-koncentrationsstigningen på den intestinale basolaterale side (figur 5B). De maksimale koncentrationer (Cmax) i mediet var omkring 2 μM for både statiske og dynamiske forhold efter 12 timers administration (Tmax).

I forbindelse med metabolismeundersøgelser blev den intravenøse administration efterlignet ved anvendelse af 2 μM APAP i leverrummets medium. APAP-koncentrationskinetetik i medierne under både statiske og dynamiske forhold indikerede, at kun ved de dynamiske forhold kunne faldne i APAP-koncentrationen påvises og nåede op på 0,87 μM APAP 12 timer efter 2 μM APAP-administration (T1/2 = 12 timer). Leverækvivalenterne viste minimal metabolisk effektivitet under statiske forhold (Figur 5C). APAP-koncentrationen nåede op på 1,7 μM 12 timer efter APAP-administration. Den integrerede, systemiske som APAP absorption og metabolisme evaluering blev udført i tarmen / lever 2-OC model. APAP blev administreret over den apikale side af tarmen ækvivalent, efterligne den mundtlige rute. Medium prøver blev indsamlet fra begge tarmsider og også fra leveren rum. Figur 5D viser apap-koncentrationens gradvise henfald på den apikale side under både statiske og dynamiske forhold.

Figur 5E viser forskellige absorptions- og stofskiftefaser. Strømmen påvirkede også tarmabsorptionen. APAP Cmax i mediet ændret fra 2 μM på "Tarm 2-OC" (Figur 5B) samling til 1,7 μM for den dynamiske "Tarm / lever 2-OC" (Figur 5E). Figur 5F viser en direkte sammenligning mellem koncentrationen-tid profil APAP i vores dynamiske "Tarm / lever 2-OC" mikrofysiologiske system (rød kurve og y akse) og en repræsentativ profil opnået hos mennesker efter en enkelt oral dosis på 1000 mg (sort kurve og y akse).

Figure 1
Figur 1: Skematisk trin kompilering for PK undersøgelser i 2-OC MPS. A)Skematisk tegning af 2-OC MPS, der viser tarm- og levervævsækvivalenter i bottom-up-visning. B) 2-OC MPS fotografi med tarm- og leverækvivalenter integreret i enheden i bottom-up-visning med repræsentative optiske mikroskopiske billeder. C) Tidslinje for præparat til fremstilling af vævsækvivalenter, APAP-behandling og kulturmediumsamlingsfaser til organoidfremstilling og farmakokkinetiske og toksikologiske vurderinger. Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Levedygtighed og toksikologisk vurdering af tarmækvivalenterne. A)Repræsentative konfokale fluorescensmikroskopibilleder af ikke-behandlede Caco-2/HT-29-celler, der er besyvet med cellekerner og actinfilamenter fluorescerende farvestof (henholdsvis DAPI og Phalloidin) 63x Forstørrelse, zoom 2.6. B)Repræsentative konfokale fluorescensmikroskopibilleder af Caco-2/HT-29-celler behandlet med 12 μM APAP i 24 timer, plettet med kerner og aktinfilamenter fluorescerende farvestof (henholdsvis DAPI og Phalloidin) 63x Forstørrelse, zoom 2.6. C) Tarmækvivalenter levedygtighed evaluering af MTT assay i både statiske og dynamiske forhold. De værdier, der repræsenteres af søjlerne i diagrammet, beregnes i forhold til køretøjskontrol (tidspunkt navngivet som 0)*P<0,05 0 vs. behandling. D)Teer-udviklingen i løbet af de 21 dages differentiering. *P<0,05 dag 1 vs andre dage. E)TEER værdier efter APAP administration i tarmen 2-OC MPS under dynamiske forhold. Genekspression i tarme ækvivalenter. Absorptionspotentialet for tarmbarrieren og mulige virkninger af 12 μM APAP i 24 timer under dynamisk stand blev verificeret af SLC5A1 (F),Na-K-ATPase (G) og MDR1 (H) udtryk. Værdier repræsenterer det gennemsnitlige ± SEM for tre uafhængige eksperimenter. Resultatet udtrykkes som et forhold til husholdning GAPDH. *P<0,05 køretøj vs APAP. I)Operette billed-baserede HCA udført af Columbus® 2.4.0. Software. Repræsentative billeder af 2D tarm co-kultur i forskellige tidspunkter efter 12 μM APAP behandling. Negative kontroller var mellemstore (0 timer) eller køretøjer (0,5% ethanol). Positive kontroller vist her er 100 mM APAP. Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Levedygtighed og toksikologisk vurdering af leverækvivalenter. A)Leverækvivalenter levedygtighed evaluering af MTT assay i både statiske og dynamiske forhold. De værdier, der repræsenteres af søjlerne i grafen, beregnes procent i forhold til køretøjskontrol (tidspunkt navngivet som 0) *P<0,05 0 vs. behandling. B) Repræsentanter konfokale billeder taget fra køretøjet og 2 μM APAP 24 h behandlet lever sfæroider fra en indre sektion. C) Repræsentanter H&E (hæmaxylin og eosin farvning) billeder taget fra køretøjet og 2 μM APAP 24 h behandlet lever sfæroider fra en indre sektion. Skalabar = 50 μm. D) Repræsentative billeder af 2D-leverens co-kultur på forskellige tidspunkter efter 2 μM APAP-behandling. Prøver behandlet med køretøj og med 2 μM APAP blev overvejet i disse analyser. Fluorophore farvestof blandingen omfatter Hoechst for nuklear farvning og Mitotracker Deep Red for mitokondrier masse farvning. Negative kontroller var mellemstore (0 timer) eller køretøjer (0,5% ethanol). Positive kontroller var 100 mM APAP. Målinger af hele sfæroider billeder taget blev udført ved hjælp af Fiji software. E)Frekvensfordelinger af området F)højde-bredde-forhold, G) rundhed, H) soliditet, I) cirkularitet. N = 85. *p < 0,05. J)Repræsentative billeder af 3D-lever sfæroider erhvervet af Operette ved hjælp af LWD 10x mål. Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Levernes levedygtighed/funktionalitet og mulige virkninger af 2 μM APAP under statiske og dynamiske forhold over det blev verificeret ved genet og proteinudsetryk og ved enzymatisk aktivitet. A) albumin genekspression. B)GSTA2-genekspression. Leverevne til at udføre fase I- og fase II-metabolisme og mulige virkninger af 2 μM APAP i 24 timer under dynamisk stand over det blev verificeret ved genekspression af CYP3A4 (C) og ved henholdsvis UGT1A1 (D). E) Total albumin protein udtryk under statisk tilstand. F) Total albumin protein udtryk under dynamiske forhold. Betingelse. G)Sammenlignende graf, der illustrerer forskellen i det samlede albuminudtryk i leverækvivalenter, der dyrkes og behandles under statiske eller dynamiske forhold. H) CYP 3A4 in vitro enzymatisk aktivitet under statiske forhold. I) CYP 3A4 in vitro enzymatisk aktivitet under dynamiske forhold. J)Sammenlignende graf, der illustrerer forskellen i CYP 3A4-aktivitet i leverækvivalenter, der dyrkes og behandles under statiske eller dynamiske forhold. Værdier repræsenterer det gennemsnitlige ± SEM for tre uafhængige eksperimenter. Data for genekspression udtrykkes som et forhold til husholdning GAPDH. Data for proteinudtryk udtrykkes som et forhold til vinkulinprotein. *P<0,05 køretøj vs APAP behandling. Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Analyser af APAP farmakokinetik i 2-OC MPS. APAP absorptionsprofil efter 12 μM APAP administration på den apikale side af tarmen 2-OC MPS præparat. Tarmbarrieren var lavet af en cokultur af Caco-2/HT-29 cellelinjer (A) Statiske og dynamiske APAP-koncentrationer i mediet fra den apikale side (der repræsenterer den menneskelige tarmlummenside). (B)Statiske og dynamiske APAP-koncentrationer i mediet fra basolateralsiden (der repræsenterer den menneskelige tarmblodstrømsside). *P<0,05 statisk vs dynamiske forhold. C) APAP metabolisme profil i leveren 2-OC MPS af HepaRG/HHSTeC lever sfæroider. Sammenligning af statiske og dynamiske forhold efter 2 μM APAP-administration i mediet. *P<0,05 0h vs 6 h, 12 h og 24 h APAP-behandling. APAP absorption og metabolisme profil efter 12 μM administration på tarmbarrieren apical side af tarmen / lever 2-OC MPS præparat. Dette emulerer den mundtlige rute. Tarmbarrieren var lavet af Caco-2/HT-29 cellelinjer og leveren ækvivalent lavet af sfæroider af HepaRG/HHSTeC cellelinjer. d) Koncentrationer i tarm/lever 2-OC APAP i tarmbarrierens apikale side under statiske og dynamiske forhold. (E)Koncentrationer i tarm/lever 2-OC APAP i mediet under statiske og dynamiske forhold. *P<0,05 statisk vs dynamiske forhold. (F)Sammenligning mellem koncentrations-tidsprofilen for APAP i vores mikrofysiologiske system (rød kurve og y-akse) og en repræsentativ profil opnået hos mennesker efter en enkelt oral dosis på 1000 mg (sort kurve og y-akse). Data blev udvundet fra plots ved hjælp af WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019). Klik her for at se en større version af dette tal.

HPLC-system Waters Alliance 2695 (Milford, MA, USA), udstyret med kvatorædræmi pumpe, prøve manager og degasser
Detektor Waters 2996 Uv-Vis sat i 210-400 nm rækkevidde
Systemstyring, dataindsamling og behandling Waters Empower 2002 kromatografi software
Kolonne Omvendt fase Luna C18
(150 x 4,6 mm ID; 5 mm partikelstørrelse)
Fænomenet
Beskyttelseskolonne Omvendt fase Luna C18 (4 x 3 mm)
Fænomenet
Mobil fase Opløsningsmiddel A- Acetonitrile
Opløsningsmiddel B- 0,10 M ammoniumacetat, pH 6,8
Isokratiske forhold Tidspunkt A (%) B (%)
(min.)
15 5 95
Flow 1,0 ml/min.
Injektionsvolumen 25 μL
Temperatur 25 °C
APAP-registrering UV @ 243 og 254 nm
Kørselstid 15 minutter

Tabel 1: Betingelser og parametre, der skal anvendes til HPLC-UV-analyser af APAP i kulturmediummaer.

Nominel koncentration Beregnet APAP-koncentration (μM) Gennemsnit (μM) S.D.b C.V. Dev
(μM) (Tre eksemplarer af hver koncentration) (μM) (%)c (%)d
Analysenummer 1 2 3 4 5 6
0.25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46,05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17,08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0,09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0,03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tabel 2: Variation mellem drevne – nøjagtighed, præcision og linearitet af standardkurveprøver fremstillet i en blanding af DMEM-medium med 0,10 M ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v) fra seks separate analyser. a.
a. Der blev monteret en lineær kurve på dataene for respons (APAP) versus teoretisk koncentration som beskrevet i eksperimentel. Den beregnede koncentration blev afledt af læsningen af responsen for hver standardprøve i forhold til kalibreringskurven. Hver post (analyse 1-6) svarer til den gennemsnitlige værdi af tre eksemplarer analyse.
b. SD= Standardafvigelse.
kr. C.V. (variationskoefficient. præcision).
d. Nøjagtighed (DEV %) = afvigelsen af den beregnede koncentration fra den nominelle værdi.
Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019).

Nominel koncentration Beregnet APAP-koncentration (μM) Gennemsnitlige S.D.b C.V. Dev
(μM) (Tre eksemplarer af hver koncentration) (μM) (μM) (%)c (%)d
Analysenummer 1 2 3 4 5
0.25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26,03
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14,97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6,85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1,56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0,01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0,05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tabel 3: Variation mellem drevne – nøjagtighed, præcision og linearitet af standardkurveprøver fremstillet i en blanding af Williams-medium med 0,10 M ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v) fra seks separate analyser. a.
a. Der blev monteret en lineær kurve på dataene for respons (APAP) versus teoretisk koncentration som beskrevet i eksperimentel. Den beregnede koncentration blev afledt af læsningen af responsen for hver standardprøve i forhold til en kalibreringskurve. Hver post (analyse 1-5) svarer til den gennemsnitlige værdi af tre eksemplarer analyse.
b. SD= Standardafvigelse.
kr. C.V. (variationskoefficient. præcision).
d. Nøjagtighed (DEV %) = afvigelsen af den beregnede koncentration fra den nominelle værdi.
Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019).

Williams medium Nominel koncentration Målt koncentration S.D. C.V. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-kørsel (n=3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1,77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8,37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8,57
Inter-run (n=15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14,97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2,99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5,88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5,31
DMEM medium Nominel koncentration Målt koncentration S.D. C.V. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-kørsel (n=3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6,35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1,04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1,69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4,00
Inter-run (n=12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7,75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tabel 4: Intra- og interkørselspræcision og -nøjagtighed for APAP i kvalitetskontrolprøver. a.
a. Dataene vises som gennemsnit. SD (standardafvigelse). CV (variationskoefficient. præcision) og nøjagtighed (procentafvigelse. DEV%).
Dette tal er blevet ændret fra Marin et al. Acetaminophen absorption og metabolisme i en tarm / lever mikrofysiologiske system. Chem Biol Interagere. 299, 59-76 (2019).

Primer (5' → 3')
Væv Gen Frem Omvendt
Tarmen SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgaCggT
NA-K-ATPase ACCGCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgtCC
MDR1 TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTgg
Leveren Albumin TgCAAggCTgATAAggAg TTTAgACAgggTgTTGGCTTTACAC
GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgC AgCAgAgggaAggCtggAAATAAg
CPY3A4 ggAAggTggACCCAgAAACTGC TTACggTgCCATCCCTTGAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgTgAAggCTggAg

Tabel 5: QPCR-primere i realtid til vurdering af gentransskription på mRNA-niveau i 2-OC-kulturer for tarm- og levervæv

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nøjagtige og pålidelige vurdering af de farmakologiske egenskaber ved efterforskningsmæssige nye lægemidler er afgørende for at reducere risikoen i de følgende udviklingstrin. Mps er en forholdsvis ny teknologi, der har til formål at forbedre den prædiktive effekt og reducere omkostninger og tid brugt med prækliniske tests. Vores gruppe er fremme i vurderingen af farmakokoptiske og toksikologiske egenskaber for det meste er nødvendige for bly optimering. Vi arbejdede med 2-OC microfluidic enhed, som har to kamre, så integrationen af to organoider. APAP blev valgt, fordi det har masser af høj kvalitet menneskelige data, er for det meste metaboliseres af leveren, og viser også hepatotoksiske egenskaber. Undersøgelsesprotokollen havde til formål at efterligne nogle trin i det kliniske forsøg i den menneskelige fase I, hvor et lægemiddel administreres oralt til frivillige, og der udtages periodiske blodprøver for at vurdere lægemidlernes koncentration for at kende de farmakokiske egenskaber og biokemiske og kliniske parametre indsamles for at vurdere sikkerheden og tolerabiliteten. Derfor, når MPS udvikler sig nok til at give pålidelige forudsigelser, vil det reducere risikoen for fiasko i fase I-studiet. Ved at tilføje sygdomsmodellerne i fremtiden vil den samme antagelse muligvis gælde for de kliniske fase II- og III-forsøg.

Alle undersøgelser blev udført i tre modeller: Tarm 2-OC (APAP oral administration), Lever 2-OC (Intravenøs administration), og tarm /lever 2-OC (oral administration). Den første model isolerede absorptionen, den anden stofskiftet, og den tredje integreret begge dele. Vi producerede først organoiderne og inkorporerede i mikrofluidisk anordning, administrerede apap'en for det andet og indsamlede medieprøverne og udførte sidst en række test for at vurdere cellens levedygtighed og funktionalitet og den toksikologiske virkning af APAP-eksponeringen. Til farmakoketiske undersøgelser udviklede og validerede vi en kromatografisk metode til APAP-kvantificering i mediet. Valideringen overholdt retningslinjen om bioanalytisk metodevalidering vedrørende specificitet, linearitet, kvantificeringsgrænsen (LOQ), detektionsgrænsen (LOD), matrixeffekt, præcision og nøjagtighed, som skitseret af FDA29,30. Specificiteten blev fastslået med blanke, samlede og individuelle biologiske prøver fra to forskellige kilder. Metoden blev udført på acceptabl vis under analysen, og dataene bekræftede, at en simpel isokratisk mobilfase var i stand til at adskille og kvantificere APAP.

Tarm- og leverorganoidernes levedygtighed/funktionelt blev vurderet ud fra forskellige teknikker. For tarmækvivalenten påvisning af konfokal fluorescensmikroskopi (figur 2A-B), MTT-analysen( figur2C), vurdering af genekspression (figur 2D-F)eller HCA-eksperimentet, påvisning af nogen toksicitet 24 timer efter APAP-eksponering. Ligeledes, MTT assay ikke opdage giftige fornærmelser induceret af APAP i leverækvivalenter (Figur 3A). HCA-teknikken tilføjede imidlertid muligheden for påvisning af meget tidlige toksiske hændelser (24 timer efter APAP-eksponering) for leverceller ved observation af cellefekypiske ændringer med nogle mekanistiske spor (Figur 3D). På den anden side viste det sig, at konfokal fluorescensmikroskopi (figur 3B) og histologi (figur 3C) var et nyttigt supplerende redskab i undersøgelsen af levedygtigheden af det humane vævs ækvivalenter. For levercellerne var den samtidige brug af forskellige teknikker meget fordelagtig. MTT-analysen var som nævnt tidligere ikke i stand til at påvise APAP-cytotoksiciteten, der blev påvist ved HCA 24 timer efter APAP-eksponeringen. Genudtryksanalyserne vurderede tarmens funktionalitet (figur 2D-F) og leverorganoider (figur 4A-D) ved både basal og 24 timer efter APAP-behandling. Under basale forhold, der var normale niveauer af tarm-og lever-specifikke markører, tyder på korrekt funktionalitet. Efter 24 timers APAP eksponering, var der en nedregulering af albumin, GST mRNA niveauer, og en tendens til at reducere CYP3A4 genekspression i leveren ækvivalent væv, hvilket indikerer APAP tidlig cytotoksicitet. Underbyggende disse resultater, vestlige blotting eksperimenter viste, at reduktionen i genekspression også blev ledsaget af en robust reduktion i leveren samlede albumin protein udtryk som reaktion på APAP behandling (Figur 4E-F), bekræfter de giftige fornærmelser pålagt levervæv ved eksponering for APAP. Forsøg med in vitro enzymatisk aktivitet viste derfor en robust og progressiv reduktion i CYP 3A4-aktivitetsniveauet forårsaget af APAP-behandling ileverækvivalenter( Figur 4H-I).

Morfometriske statistikker over organoider blev udført på billede J (Figur 3E-I). Området afslører, hvor tæt 2D-størrelsen er på alle analyserede organoider, som kan bruges som standardisering i denne protokol, så der kan produceres et upartisk resultat. »Formbeskrivelserne« afgiver statistikker, der præcist svarer til formens morfologi. Højde-bredde-forholdet er et indeks, der bruger den store og mindre akse, så resultaterne omkring 1 indikerer ingen bias (dvs. præferencevækst) under organoiddannelse. Værdier af rundhed (4 ×[område]/ (π × [hovedakse]2)) er meget følsomme over for en præferencevækst, som vil blive afsløret som en vigtig akse. Soliditet ([område]/ ([konvekst område])) er afgørende for at vise grov morfologi, da den ikke påvirkes af uregelmæssigheder i grænserne, da det anvender konvekst område (=kuvert). Distributioner centreret omkring 1,0 indikerer formodede sfærisk vækst. Omvendt er Circularity (4× π [område]/[perimeter]2) meget følsom over for en kompleks omkreds, så "hulrum" eller "lommer" ville påvirke dette indeks. Således cirkularitet omkring 1 også bekræfter formodede sfærisk vækst, kompatibel med korrekt organoid funktionalitet.

Analyseresultaterne viste, at MPS kunne emulere APAP-absorptions- og metabolismeegenskaberne, både isolerede eller integrerede i en kurve, der kan sammenlignes med den, der frembragte in vivo (figur 5F) uden udskillelsesfasen. APAP-absorptionen var den samme efter oral administration af både mps-afs i tarmen eller i tarmen/lever-MPS-modellerne under både statiske og dynamiske forhold (Figur 5A-B, Figur 5D-E). I begge var der en APAP koncentration falder på apical side samtidig med sin stigning på basolateral side, uden nogen væsentlig forskel for statiske og dynamiske forhold. I modsætning hertil varierede APAP leverskiftet under disse betingelser. De cirkulerende medier i MPS syntes at forbedre organoid metaboliske kapacitet (Figur 5C og Figur 5E). Der var en betydelig APAP henfald understrøm ikke set uden flow. Interessant, in vitro, CYP3A4 aktivitetsforsøg bekræfter hypotesen om, at tilstedeværelsen af flow i systemet øger funktionaliteten af menneskelige lever ækvivalenter. Som vist i grafen i figur 4Jvar aktiviteten af CYP 3A4 signifikant højere i leverækvivalenter, der blev opretholdt under flow ved både basale og APAP-behandlingsforhold. På samme måde udviste leverækvivalenter, der holdes under flow (dynamisk), en tendens til at øge proteinudtrykket af albumin sammenlignet med dem, der holdes uden flow (statisk) både ved baseline eller ved APAP-behandlede forhold (Figur 4G).

Sammenlignet med koncentrationstidsprofilen efter oral administration af APAP til mennesker viser vores mikrofysiologiske system meget større t1/2 (halveringstid) (Figur 5F). Dette sker, som nævnt før, fordi mens vi har en to-organ system med tarmen og leveren ækvivalenter, der kan absorbere og metabolisere stoffet, der er ingen nyre svarende til udskiller APAP og dens metabolitter fra plasma rum38. Derudover viser det mikrofysiologiske system mindre Cmax (peak plasmakoncentration) og større tmax (tid til at nå Cmax) end hvad der typisk observeres for mennesker (Figur 5F). Dette er en konsekvens af forskellene i omfanget af in vitro- og in vivo-forsøgene. Samlet set er der tre hovedforskelle mellem den koncentration-tid profil opnået ved hjælp af det mikrofysiologiske system og profiler opnået efter oral administration af APAP til mennesker: større t1/2,mindre Cmax og større tmax (Figur 5F). Mens de større t1/2 skyldes fraværet af en nyre svarende til udskille APAP og dens metabolitter fra plasma ækvivalent, mindre Cmax og større tmax er konsekvenser af den lille skala af forsøget i forhold til den menneskelige krop. De bedste skaleringsstrategier for opbygning og drift af mikrofysiologiske systemer er stadig et aktivt forskningsområde , og det er usandsynligt , at en enkelt tilgang er optimal for allesystemer 39. Derudover kan matematisk modellering eller maskinlæring bruges til at anvende korrektioner eller lære kortlægningen fra mikroskalaen til fuld skala for at ekstrapolere in vitro-data, der er indhentet med de mikrofysiologiske systemer, til in vivo-adfærden observeret hos mennesker40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon på Unit 522 INSERM og dr. Christian Trepo på Unit 271 INSERM for brugen af det biologiske materiale (Hepa RG celler) og for at stille derefter til rådighed for os for at udføre den akademiske forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Tags

Kemi Problem 166 Mikrofysiologisk System Acetaminophen ADMETox Organoids
Et mikrofysiologisk system for lægemiddelmakokinetisk og toksikologisk vurdering af tarmen/leversystemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter