تم تطوير بروتوكول احتجاز الليزر microdissection (LCM) للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الخلايا من أي أنسجة صلبة.
[رنا] عائد ة ونزاهة حاسمة ل [رنا] تحليل. ومع ذلك، غالباً ما يكون من الصعب من الناحية الفنية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء كامل ليزر التقاط microdissection (LCM) الإجراء. بما أنّ [لكم] دراسات يعمل مع [لوو كمّوتس] المادة, اهتمامات حول محدودة [رنا] غلة أيضا مهمّة. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. تم تقييم تأثير بروتوكول تلطيخ، وسمك التبريد، وكمية الأنسجة المجهرية، ومجموعة استخراج الحمض النووي الريبي، ونظام LCM المستخدمة في العائد RNA والسلامة التي تم الحصول عليها من خلايا العظام microdissected. تم إجراء ثمانية ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة باستخدام فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار LCM التجارية. كانت العينة تقع بين غشاء تيريفثالات البولي إثيلين (PET) والفيلم اللاصق. وقد استخدم نظام LCM يستخدم الجاذبية لجمع العينات وطريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود للحصول على RNAs عالية الجودة ذات العائد الكافي. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الموقع في الخلايا من أي أنسجة صلبة في كل من الظروف الفسيولوجية وعمليات المرض.
تتكون الأنسجة من أنواع الخلايا غير المتجانسة والموزعة مكانياً. قد تستجيب أنواع الخلايا المختلفة في نسيج معين بشكل مختلف لنفس الإشارة. ولذلك، فمن الضروري أن تكون قادرة على عزل مجموعات محددة من الخلايا لتقييم دور أنواع الخلايا المختلفة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. يوفر استئصال الليزر الجزئي (LCM) طريقة سريعة ودقيقة نسبيًا لعزل وإزالة خلايا محددة من الأنسجة المعقدة1. تستخدم أنظمة LCM قوة شعاع الليزر لفصل الخلايا ذات الأهمية عن أقسام الأنسجة النسيجية دون الحاجة إلى المعالجة الأنزيمية أو النمو في الثقافة. وهذا يعني أن الخلايا في موطن الأنسجة الطبيعية، وأنه يتم الاحتفاظ بنية الأنسجة بما في ذلك العلاقة المكانية بين الخلايا المختلفة. يتم الحفاظ على مورفولوجيا كل من الخلايا التي تم التقاطها والأنسجة المتبقية بشكل جيد، ويمكن أخذ عينات من العديد من مكونات الأنسجة بالتتابع من نفس الشريحة. ويمكن بعد ذلك استخدام الخلايا المعزولة للتحليل اللاحق لمحتوى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين أو المستقلب2و3.
من أجل تحليل التعبير الجيني في مختلف مجموعات الخلايا، أو بعد علاجات مختلفة، فمن الضروري الحصول على mRNAs من نوعية وكمية كافية للتحليل اللاحق4،5. على النقيض من الحمض النووي، RNAs هي أكثر حساسية للتثبيت ويوصى باستخدام الأنسجة المجمدة عندما يكون الهدف هو دراسة الحمض النووي الريبي. وبما أن هذه الحالات تتدهور بسرعة بسبب الريبونوكليس (RNase) في كل مكان، فإن هناك حاجة إلى شروط صارمة خالية من RNase أثناء مناولة العينات وإعدادها وتجنب تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التقنيات السريعة دون أي خطوات مرحلة مائية طويلة هي حاسمة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي6. ويمكن أيضا أن تتأثر العائد RNA والنزاهة من قبل عملية LCM ونظام LCM المستخدمة7،8. حاليا، أربعة أنظمة LCM مع مبادئ التشغيل المختلفة متاحة2. طريقة استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أيضا أن تكون مهمة، منذ تم اختبار مجموعات العزل RNA مختلفة مع اختلافات كبيرة في كمية الحمض النووي الريبي ونوعية7،8.
أي طريقة لإعداد الأنسجة تتطلب إيجاد توازن بين الحصول على تباين مورفولوجي جيد والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لمزيد من التحليلات. لإعداد أقسام المجمدة من العظام، تم تطوير فيلم لاصق وتحسينها باستمرار9. يتم قطع أقسام العظام وملطخة مباشرة على فيلم لاصق. هذا الفيلم لاصق ينطبق على العديد من أنواع تلطيخ، ويمكن استخدامها لعزل الخلايا ذات الفائدة من استئصال التبريد العظام باستخدام LCM9،10،11،12،13، 14. جميع الخطوات بما في ذلك الإزالة الجراحية، والتضمين، وتجميد، وقطع وتلطيخ يمكن أن تكتمل في أقل من ساعة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن تحديد الخلايا مثل osteoblasts، خلايا بطانة العظام، وosteoclasts بوضوح9،10،11، 12،13،14. هذه الطريقة لديها ميزة كونها سريعة وبسيطة. وهناك طريقة بديلة لتوليد العظام التبريد هو استخدام نظام نقل الشريط15. ومع ذلك، فإن هذه التقنية الأخيرة هي أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أجهزة إضافية، حيث أن الأقسام يجب أن تنقل من شريط لاصق على الشرائح غشاء المغلفة مسبقا عن طريق الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) عبر الربط. على الرغم من أن نظام نقل الشريط قد اقترن بنجاح مع LCM16،17،18،19،تجدر الإشارة إلى أن طلاء عبر مرتبطة يمكن أن تخلق نمط الخلفية التي يمكن أن تتداخل مع خلية من نوع تعريف20.
عادة، يتم استخراج كميات صغيرة فقط من الحمض النووي الريبي من الخلايا المجهرية، وغالبا ما يتم تقييم نوعية وكمية الحمض النووي الريبي بواسطة الكهربائي الشعيرات الدقيقة21. يتم استخدام برنامج كمبيوتر لتعيين فهرس الجودة لمقتطفات RNA يسمى رقم تكامل RNA (RIN). تشير قيمة RIN البالغة 1.0 إلى الحمض النووي الريبي المتدهور تمامًا، بينما تشير قيمة 10.0 إلى أن الحمض النووي الريبي سليم تمامًا22. عادة, اعتبرت فهرسات على 5 كاف ل [رنا] دراسات. وقد تم الإبلاغ عن أنماط التعبير الجيني في عينات تبلغ قيمتها RIN 5.0-10.0 لترتبط بشكل جيد مع بعضها البعض23. على الرغم من أن حساسية هذه الطريقة عالية، حيث يمكن الكشف عن أقل من 50 pg/μL من إجمالي الحمض النووي الريبي، فإنه يمكن أن يكون من الصعب جدا الحصول على تقييم الجودة إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي في العينة منخفض جدا. لذلك، من أجل تقييم جودة الحمض النووي الريبي، وغالبا ما يستخدم قسم الأنسجة المتبقية بعد LCM لاستخراج RNA، عن طريق أنبوب العازلة على الشريحة24.
على الرغم من أن LCM قد استخدمت على نطاق واسع على أنسجة مجمدة مختلفة، نادرا ما يتم الإبلاغ عن قيم RIN من RNAs المستخرجة. وعلاوة على ذلك، لا توجد دراسات مقارنة لتوضيح الطريقة الأنسب لدراسة الحمض النووي الريبي في عظام الماوس. في هذه الدراسة، تم استخدام أقسام مجمدة من عظم الفخذ الماوس الكبار لتحسين إعداد العينة، بروتوكول LCM واستخراج الحمض النووي الريبي من أجل الحصول على جودة عالية RNAs. وقد تم تحسين هذا البروتوكول بشكل خاص بالنسبة لنظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات.
يمكن أن تتأثر كل من نوعية وكمية الحمض النووي الريبي سلبا في جميع مراحل إعداد العينة مثل التلاعب في الأنسجة، عملية LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني اللاحقة.
بالنسبة ل…
The authors have nothing to disclose.
ويشكر المؤلفان أوتي زيتز ونيكول جينر على مساعدتهما التقنية الممتازة، فضلاً عن موظفي فيتكور ومراقبة الحيوانات على دعمهما.
2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |