Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate
Summary
È stato sviluppato un protocollo di microdissezione di cattura laser (LCM) per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l’analisi dell’espressione genica nelle cellule ossee. L’attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l’espressione genica nelle cellule di qualsiasi tessuto duro.
Abstract
La resa e l’integrità dell’RNA sono decisive per l’analisi dell’RNA. Tuttavia, è spesso tecnicamente difficile mantenere l’integrità dell’RNA durante l’intera procedura di microdissezione di cattura laser (LCM). Poiché gli studi LCM funzionano con basse quantità di materiale, anche le preoccupazioni circa le limitate rese di RNA sono importanti. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l’analisi dell’espressione genica nelle cellule ossee. È stato valutato l’effetto del protocollo di colorazione, dello spessore delle criosezioni, della quantità di tessuto microdissecazione, del kit di estrazione dell’RNA e del sistema LCM utilizzato sulla resa e l’integrità dell’RNA ottenuto dalle cellule ossee microdisseche. Le sezioni ossee congelate spesse otto m sono state realizzate utilizzando una pellicola adesiva e macchiate utilizzando un protocollo rapido per una macchia Commerciale di LCM. Il campione è stato inserito tra una membrana di terephthalate (PET) in polietilene e la pellicola adesiva. Un sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni e un metodo di estrazione dell’RNA basato su colonne è stato utilizzato per ottenere RNA di alta qualità di resa sufficiente. L’attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l’espressione genica situ in cellule di qualsiasi tessuto duro sia in condizioni fisiologiche che nei processi della malattia.
Introduction
I tessuti sono costituiti da tipi di cellule eterogenee e distribuite spazialmente. Diversi tipi di cellule in un dato tessuto possono rispondere in modo diverso allo stesso segnale. Pertanto, è essenziale poter isolare specifiche popolazioni cellulari per la valutazione del ruolo dei diversi tipi di cellule sia in condizioni fisiologiche che patologiche. La microdissezione di cattura laser (LCM) offre un metodo relativamente rapido e preciso per isolare e rimuovere le cellule specificate dai tessuti complessi1. I sistemi LCM utilizzano la potenza di un raggio laser per separare le cellule di interesse dalle sezioni del tessuto istologico senza la necessità di elaborazione enzimatica o crescita della coltura. Ciò significa che le cellule sono nel loro habitat di tessuto naturale, e che l’architettura dei tessuti tra cui la relazione spaziale tra le diverse cellule viene mantenuta. La morfologia delle cellule catturate e del tessuto residuo è ben conservata e diversi componenti del tessuto possono essere campionati in sequenza dallo stesso vetrino. Le cellule isolate possono quindi essere utilizzate per analisi successive del loro RNA, DNA, proteina o contenuto dimetaboliti 2,3.
Per analizzare l’espressione genica in diverse popolazioni cellulari, o dopo diversi trattamenti, è necessario ottenere mRNA di quantità e quantità sufficienti per la successiva analisi4,5. A differenza del DNA, gli RNA sono più sensibili alla fissazione e l’uso del tessuto congelato è raccomandato quando l’obiettivo è studiare l’RNA. Poiché gli mRNA sono rapidamente degradati da ribonucles onnipresenti (RNase), sono necessarie severe condizioni prive di RNase durante la movimentazione e la preparazione dei campioni ed evitare lo stoccaggio di campioni a temperatura ambiente. Inoltre, tecniche rapide senza fasi di fase acquose prolungate sono cruciali per prevenire la degradazione dell’RNA6. La resa e l’integrità dell’RNA possono anche essere influenzate dal processo LCM e dal sistema LCM utilizzato7,8. Attualmente, sono disponibili quattro sistemi LCM con diversi principi operativi2. Il metodo di estrazione dell’RNA può anche essere importante, dal momento che diversi kit di isolamento dell’RNA sono stati testati con differenze significative nella quantità e qualità dell’RNA7,8.
Qualsiasi metodo di preparazione dei tessuti richiede di trovare un equilibrio tra l’ottenimento di un buon contrasto morfologico e il mantenimento dell’integrità dell’RNA per ulteriori analisi. Per la preparazione di sezioni congelate dall’osso, è stata sviluppata una pellicola adesiva e continuamente migliorata9. Le sezioni ossee vengono tagliate e macchiate direttamente sulla pellicola adesiva. Questo film adesivo è applicabile a molti tipi di colorazione e può essere impiegato per isolare le cellule di interesse dalle criosezioni ossee utilizzando LCM9,10,11,12,13, 14. Tutti i passaggi, tra cui la rimozione chirurgica, l’incorporamento, il congelamento, il taglio e la colorazione possono essere completati in meno di un’ora. È importante sottolineare che cellule come osteoblasti, cellule di rivestimento osseo e osteoclasts possono essere chiaramente identificate9,10,11,12,13,14. Questo metodo ha il vantaggio di essere rapido e semplice. Un metodo alternativo per la generazione di criosezioni ossee consiste nell’utilizzare il sistema di trasferimento del nastro15. Tuttavia, quest’ultima tecnica richiede più tempo e richiede una strumentazione aggiuntiva, poiché le sezioni devono essere trasferite dal nastro adesivo su vetrini a membrana prerivestiti mediante collegamento incrociato ultravioletto (UV). Sebbene il sistema di trasferimento a nastro sia stato accoppiato con successo con LCM16,17,18,19, va notato che il rivestimento incrociato può creare un modello di sfondo che può interferire con l’identificazione del tipo di cella20.
Tipicamente, solo piccole quantità di RNA vengono estratte da cellule microdissected, e la qualità e la quantità dell’RNA sono spesso valutate dall’elettroforesi micro-capillare21. Un programma per computer viene utilizzato per assegnare un indice di qualità agli estratti di RNA chiamati RNA integrity number (RIN). Un valore RIN di 1,0 indica RNA completamente degradato, mentre un valore di 10,0 suggerisce che l’RNA è completamente intatto22. Di solito, gli indici superiori a 5 sono considerati sufficienti per gli studi sull’RNA. Sono stati riportati modelli di espressione genica in campioni con un valore RIN di 5,0,10,0 per correlare bene tra loro23. Anche se la sensibilità di questo metodo è elevata, dal momento che è possibile rilevare appena 50 pg/L di RNA totale, può essere molto difficile ottenere una valutazione della qualità se la concentrazione di RNA nel campione è molto bassa. Pertanto, al fine di valutare la qualità dell’RNA, la sezione tissutale rimanente dopo il LCM viene spesso utilizzata per estrarre l’RNA, pipetting buffer sulla diapositiva24.
Anche se LCM è stato ampiamente utilizzato su diversi tessuti congelati, valori di RIN di RNA estratti sono raramente segnalati. Inoltre, non esistono studi comparativi per chiarire il metodo più appropriato per studiare l’RNA nelle ossa dei topi. Nel presente studio, sezioni congelate di femori murini adulti sono stati utilizzati per ottimizzare la preparazione del campione, il protocollo LCM e l’estrazione dell’RNA al fine di ottenere RNA di alta qualità. Il protocollo attuale è stato ottimizzato in particolare per il sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sia la qualità dell’RNA che la quantità possono essere influenzate negativamente in tutte le fasi della preparazione del campione, come la manipolazione dei tessuti, il processo LCM e l’estrazione dell’RNA. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la successiva analisi dell’espressione genica.
Per LCM, la maggior parte dei laboratori utilizza le sezioni di 7,8 m di spessore2. Sezioni più spesse consentirebb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Ute e Nikole Ginner per il loro eccellente aiuto tecnico, così come il personale Vetcore e la cura degli animali per il loro supporto.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Riferimenti
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