Ein Laser Capture Microdissection Protocol, das hochwertige RNA aus frisch gefrorenen Mausknochen liefert
Summary
Ein Lasercapture Microdissection (LCM) Protokoll wurde entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die Genexpression in Zellen von hartgeweben zu untersuchen.
Abstract
RNA-Ausbeute und -Integrität sind entscheidend für die RNA-Analyse. Es ist jedoch oft technisch schwierig, die RNA-Integrität während des gesamten Lasercapture Microdissection (LCM)-Verfahrens aufrechtzuerhalten. Da LCM-Studien mit geringen Materialmengen arbeiten, sind auch Bedenken hinsichtlich begrenzter RNA-Ausbeute nera wichtig. Daher wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die Wirkung von Färbeprotokoll, Dicke von Kryosektionen, mikrosezierte Gewebemenge, RNA-Extraktionskit und LCM-System, das auf die RNA-Ausbeute und Integrität von mikrosezierten Knochenzellen verwendet wird, wurde bewertet. Acht Meter dicke gefrorene Knochenabschnitte wurden mit einem Klebefilm hergestellt und mit einem schnellen Protokoll für einen kommerziellen LCM-Fleck gebeizt. Die Probe wurde zwischen einer Polyethylenterephthalatmembran (PET) und der Klebefolie eingeklemmt. Ein LCM-System, das die Schwerkraft für die Probenentnahme verwendet, und eine säulenbasierte RNA-Extraktionsmethode wurden verwendet, um qualitativ hochwertige RNAs mit ausreichender Ausbeute zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die In-situ-Genexpression in Zellen von hartgeweben sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch bei Krankheitsprozessen zu untersuchen.
Introduction
Gewebe bestehen aus heterogenen und räumlich verteilten Zelltypen. Verschiedene Zelltypen in einem bestimmten Gewebe können unterschiedlich auf dasselbe Signal reagieren. Daher ist es wichtig, spezifische Zellpopulationen für die Beurteilung der Rolle verschiedener Zelltypen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Bedingungen zu isolieren. Lasercapture Microdissection (LCM) bietet eine relativ schnelle und präzise Methode zum Isolieren und Entfernen bestimmter Zellen aus komplexen Geweben1. LCM-Systeme nutzen die Kraft eines Laserstrahls, um die von Interesse interessierten Zellen von histologischen Gewebeabschnitten zu trennen, ohne dass eine enzymatische Verarbeitung oder kulturförderndes Wachstum erforderlich ist. Dies bedeutet, dass sich die Zellen in ihrem natürlichen Gewebelebensraum befinden und dass die Gewebearchitektur einschließlich der räumlichen Beziehung zwischen verschiedenen Zellen erhalten bleibt. Die Morphologie sowohl der eingefangenen Zellen als auch des Restgewebes ist gut erhalten, und mehrere Gewebekomponenten können sequenziell aus demselben Dia abgetastet werden. Isolierte Zellen können dann für die nachfolgende Analyse ihres RNA-, DNA-, Protein- oder Metabolitengehalts2,3verwendet werden.
Um die Genexpression in verschiedenen Zellpopulationen oder nach verschiedenen Behandlungen zu analysieren, ist es notwendig, mRNAs von ausreichender Qualität und Quantität für die nachfolgende Analyse zu erhalten4,5. Im Gegensatz zur DNA sind RNAs empfindlicher auf Fixierung und die Verwendung von gefrorenem Gewebe wird empfohlen, wenn das Ziel darin besteht, RNA zu untersuchen. Da mRNAs durch allgegenwärtige Ribonukleasen (RNase) schnell abgebaut werden, sind strenge RNase-freie Bedingungen bei der Probenhandhabung und -aufbereitung erforderlich und die Vermeidung der Lagerung von Proben bei Raumtemperatur. Darüber hinaus sind schnelle Techniken ohne verlängerte wässrige Phasenschritte entscheidend, um den RNA-Abbau zu verhindern6. Die RNA-Ausbeute und -Integrität kann auch durch den LCM-Prozess und das verwendete LCM-System7,8beeinflusst werden. Derzeit stehen vier LCM-Systeme mit unterschiedlichen Betriebsprinzipien zur Verfügung2. Die Methode der RNA-Extraktion kann ebenfalls wichtig sein, da verschiedene RNA-Isolationskits mit signifikanten Unterschieden in RNA-Menge und-Qualität7,8getestet wurden.
Jede Gewebevorbereitungsmethode erfordert, ein Gleichgewicht zwischen dem Erhalt eines guten morphologischen Kontrasts und der Aufrechterhaltung der RNA-Integrität für weitere Analysen zu finden. Zur Herstellung gefrorener Abschnitte aus Knochen wurde ein Klebefilm entwickelt und kontinuierlich verbessert9. Die Knochenabschnitte werden direkt auf der Klebefolie geschnitten und gebeizt. Dieser Klebefilm ist auf viele Arten von Färbung anwendbar und kann verwendet werden, um die Zellen von Interesse von Knochenkryosektionen mit LCM9,10,11,12,13, zu isolieren 14. Alle Schritte einschließlich der chirurgischen Entfernung, Einbettung, Gefrieren, Schneiden und Färben können innerhalb von weniger als einer Stunde abgeschlossen werden. Wichtig ist, dass Zellen wie Osteoblasten, Knochenfutterzellen und Osteoklasten eindeutig identifiziert werden können9,10,11,12,13,14. Diese Methode hat den Vorteil, schnell und einfach zu sein. Eine alternative Methode zur Erzeugung von Knochenkryosektionen ist die Verwendung des Bandübertragungssystems15. Letztere Technik ist jedoch zeitaufwändiger und erfordert zusätzliche Instrumentierung, da die Abschnitte durch ultraviolette (UV) Vernetzung vom Klebeband auf vorbeschichtete Membranschlitten übertragen werden müssen. Obwohl das Bandübertragungssystem erfolgreich mit LCM16,17,18,19gekoppelt wurde, ist zu beachten, dass die vernetzte Beschichtung ein Hintergrundmuster erzeugen kann, das kann die Zelltyp-Identifikation20stören.
Typischerweise werden nur geringe Mengen rna aus mikrosesektierten Zellen extrahiert, und RNA-Qualität und -Menge werden oft durch mikrokapillare Elektrophorese21bewertet. Ein Computerprogramm wird verwendet, um RNA-Extrakten, die als RNA-Integritätsnummer (RIN) bezeichnet werden, einen Qualitätsindex zuzuweisen. Ein RIN-Wert von 1,0 gibt vollständig abgebaute RNA an, während ein Wert von 10,0 darauf hindeutet, dass die RNA vollständig intakt ist22. In der Regel werden Indizes über 5 als ausreichend für RNA-Studien betrachtet. Genexpressionsmuster in Proben mit einem RIN-Wert von 5,0 bis 10,0 korrelieren den Angaben zufolge gut miteinander23. Obwohl die Sensitivität dieser Methode hoch ist, da nur 50 pg/l der gesamten RNA nachgewiesen werden können, kann es sehr schwierig sein, eine Qualitätsbewertung zu erhalten, wenn die RNA-Konzentration in der Probe sehr gering ist. Um die RNA-Qualität zu beurteilen, wird daher der nach dem LCM verbleibende Gewebeabschnitt häufig zur Extraktion von RNA verwendet, indem der Puffer auf denDia24pipetiert wird.
Obwohl LCM ausgiebig auf verschiedenen gefrorenen Geweben verwendet wurde, werden RIN-Werte von extrahierten RNAs selten berichtet. Darüber hinaus gibt es keine vergleichenden Studien, um die am besten geeignete Methode zur Untersuchung von RNA in Mausknochen zu klären. In der vorliegenden Studie wurden gefrorene Abschnitte von erwachsenen Mausfemuren verwendet, um die Probenvorbereitung, das LCM-Protokoll und die RNA-Extraktion zu optimieren, um qualitativ hochwertige RNAs zu erhalten. Das vorliegende Protokoll wurde speziell für das LCM-System optimiert, das die Schwerkraft für die Probenentnahme verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sowohl die RNA-Qualität als auch die RNA-Menge können in allen Stadien der Probenvorbereitung negativ beeinflusst werden, wie z. B. Gewebemanipulation, LCM-Prozess und RNA-Extraktion. Daher wurde ein LCM-Protokoll entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die nachfolgende Genexpressionsanalyse zu erhalten.
Für LCM verwenden die meisten Laboratorien Abschnitte mit einer Dickevon 7bis 8 m 2 . Dickere Abschnitte würden es ermöglichen, mehr Material zu ernten….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Ute Zeitz und Nikole Ginner für ihre hervorragende technische Hilfe sowie dem Vetcore- und Tierpfleger für die Unterstützung.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Riferimenti
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