Summary
Detrusor içermeyen mesane modeli, idrarın depolanması ve boşaltılmasını sırasında suburothelium/lamina propria'da biyolojik olarak aktif mediatör bulunabilirliğinin düzenlenmesi için yerel mekanizmaları incelemek için suburothelium'a doğrudan erişim sağlar. Hazırlık, bozulmamış bir mesanenin doldurulmasını çok benzer şekilde andırır ve basınç hacmi çalışmalarının sistemik etkiler olmadan yapılmasını sağlar.
Abstract
Daha önceki çalışmalar, Ussing odalarına yapıştırılmış ve hidrostatik basınç veya mekanik streç teki değişikliklere maruz kalan düz mesane mukozalarından ve hidrostatik basınç değişiklikleri, esneme, hücre şişmesi veya sürükleme kuvvetleri üzerine kültürlü ürotelyal hücrelerden ve dolgu sonunda mesane lümeninde kimyasal maddelerin salınımını ortaya çıkarmış. Bu bulgular, bu mediatörlerin mesane dolgusu sırasında suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) olarak da salındıkları ve mesane duvarının derinliklerindeki hücreleri etkileyip mesane uyarılabilirliğini düzenleyeceği varsayımına yol açmıştır. Bu tür çalışmalarda en az iki belirgin sınırlama vardır: 1) Bu yaklaşımların hiçbiri SubU/LP'de arabulucuların varlığı hakkında doğrudan bilgi sağlamaz ve 2) kullanılan uyaranlar fizyolojik değildir ve mesanenin otantik dolgusunu tekrarlamaz. Burada, mesane dolgusu seyrinde mesane mukozasının suburothelial yüzeyine doğrudan erişim sağlayan bir prosedürü tartışıyoruz. Oluşturduğumuz mürin detrusorsuz preparat, bozulmamış mesanenin doldurulmasını çok benzer şekilde andırır ve omurilik refleksleri ve detrusor düz kaslardan gelen kafa karıştırıcı sinyal yokluğunda mesane üzerinde basınç-hacim çalışmalarıyapılmasını sağlar. Yeni detrusor içermeyen mesane modelini kullanarak, yakın zamanda arabulucuların intravesical ölçümlerinin mesane dolgusu sırasında SubU/LP'de salınan veya mevcut olan alabilen lere vekil olarak kullanılamayacağını gösterdik. Model, mesane dolumu sırasında metabolizma tarafından üretilen ve/veya SubU/LP'ye taşınan ürotelyum kaynaklı sinyal moleküllerinin incelenmesini sağlayarak mesanenin nöronlarına ve düz kaslarına bilgi aktarımı sağlar ve kontinent ve mikturition sırasında uyarılabilirliğini düzenler.
Introduction
Bu modelin amacı mesane dolgu farklı aşamalarında mesane mukozasının submukozal tarafına doğrudan erişim sağlamaktır.
Kritik hacim ve basınca ulaşıldığında mesane dolum sırasında erken kasılma ve boşalmaktan kaçınmalıdır. Anormal kontinans veya idrar voiding sık sık mesane dolgu seyrinde detrusor düz kas (DSM) anormal uyarılabilirlik ile ilişkilidir. DSM'nin uyarılabilirliği, düz kas hücrelerine özgü faktörler ve mesane duvarı içindeki farklı hücre tiplerinin ürettiği etkiler le belirlenir. Üriner mesanenin duvarı ürotelium (mukoza), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor düz kas (DSM) ve serosa 'dan(Şekil 1A)oluşur. Ürotelyum şemsiye hücrelerden (yani, ürotelyumun en dış tabakası), ara hücrelerden ve bazal hücrelerden (yani ürotelin en iç tabakasından) oluşur. Interstisyel hücreler, fibroblastlar, afferent sinir terminalleri, küçük kan damarları ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre türleri SubU/LP'de bulunur. Bu yaygın mesane ürotelyyum SubU / LP ve DSM hücreleri etkileyen submukoza içine arabulucu bırakarak refleks micturition ve kontinansbaşlatan bir duyu organı olduğu varsayılır1 ,2,3. Çoğunlukla, bu tür varsayımlar arabulucuların salınımını göstermiştir çalışmalara dayanmaktadır: hidrostatik basınçdeğişiklikleremaruz mukoza parçalarından 4,5; streç maruz kültürlü ürotellial hücrelerden6,7, hipotonisite kaynaklı hücreşişme7 veya sürükleme kuvvetleri8; reseptör veya sinir aktivasyonu üzerineizole mesane duvar şeritleri 9,10,11,12,13,14; ve mesane lümeni sonunda mesane dolgusularında 15,16,17,18,19. Bu tür çalışmalar mesane duvarı segmentleri veya kültürlü ürotelyal hücrelerin mekanik stimülasyon üzerine arabulucuların salınımını göstermek için etkili iken, onlar mesane dolgu üretmek fizyolojik uyaranlarla ortaya çıkan submukoza da arabulucuların serbest bırakılması için doğrudan kanıt tarafından desteklenmesi gerekir. Bu SubU / LP mesane duvarının derin mesane dolgu sırasında SubU / LP çevresine doğrudan erişim engel bulunan verilen zor bir görevdir.
Burada, mesane ürotelyumu, DSM ve mesane duvarındaki diğer hücre tipleri arasındaki sinyalizasyona katılan mechanotransdüksiyonun lokal mekanizmaları üzerinde çalışmaları kolaylaştırmak için geliştirilen detrusor kası13 ile ademi merkeziyetçi (ex vivo) murine mesane modelini gösteriyoruz. Bu yaklaşım düz mesane duvar tabakaları, mesane duvar şeritleri veya kültürlü ürotelyal hücreler kullanmaktan daha üstündür, çünkü mesanedeki fizyolojik basınç ve hacimlere yanıt olarak serbest bırakılan veya oluşan ürotenyum kaynaklı mediatörlerin SubU/LP çevresinde doğrudan ölçümlere izin verir ve hücre kültüründeki potansiyel henotypik değişimleri önler. SubU/LP'deki arabulucuların mesane dolgusu farklı aşamalarında kullanılabilirliğini, salınımını, metabolizmasını ve transurothelial naklini ölçmek için kullanılabilirliği, salınımını, metabolizmasını ve transurothelial naklini ölçmek için kullanılabilir(Şekil 1B). Hazırlık ayrıca aşırı aktif ve az aktif mesane sendromları modellerinde ürotelyal sinyalizasyon ve mekanotransdüksiyon uzerinde nisrarl incelemede de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yazıda tanımlanan hayvanlarla ilgili tüm işlemler, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüleri Rehberi ve Nevada Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi'ne göre yürütülmüştür.
NOT: Burada sunulan model, detrusor kasının çıkarılmasından oluşurken, ürotelyum ve SubU/LP sağlam kalarak(Şekil 1B)araştırmacıların mesane dolgusu sırasında SubU/LP'ye doğrudan erişimini sağlar.
1. Detrusor içermeyen Mesane Hazırlığıdise
- İzole mesanesoğuk (10 °C) dolu ve %5 CO2/95 % O2 Krebs bikarbonat çözeltisi (KBS) ile oksijenli bir kesişen tabağa aşağıdaki bileşimle (mM) yerleştirin: 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dekstroz, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
- İzole mesanenin kubbesinin küçük bir kısmını KBS ile dolu Sylgard kaplı bir kesme kabına sabitleyin. Pimin SubU/LP'ye bakan kasın en iç kenarından serosa'nın bir parçasından veya en dıştaki kenarından geçtiğinden emin olun.
- Bir mikroskop kullanarak, üretra ve üreterleri tanımlayın ve her birini diseksiyon kabının altına sabitleyin.
- Mesane, üretra ve her iki üreterin tüm ana gövdesi görüntülenir, böylece aşırı yağ ve bağ dokuları çıkarın.
- Üreterleri 6-0 naylon dikişlerle bağlayın. Daha sonra, hazırlama güvenliğini sağlamak için kesitlerin açık uçlarını diseksiyon kabının altına doğru sabitleyin.
- İnce uçlu forceps kullanarak, yavaşça üreter ve mesane gövdesi arasındaki köşesinde serosa bir parça çekin.
- Saydamlığı artırmak ve detrusor kasının altındaki submukozanın kenarboşluğunu ayırt etmek için mikroskopun ışığını ayarlayın.
- Kesmeye başlayın(soyma değil!) mesane duvarını detrusor kas tabakasının iç yüzeyi boyunca ince uçlu makaslarla keserken, kesme segmentini hazırlıktan hafifçe çekin. Her zaman, mukozanın lateral kenarı görülebilir ve dokunmaktan kaçının emin olun.
- Preparat ın pozisyonu detrusor kas dışarı diseksiyon devam etmek için rahat böylece diseksiyon çanak etrafında çevirerek tamamen detrusör kas çıkarın.
- Protokolün kalan adımları sırasında hazırlık immobilize yeteneği sağlamak için mesane kubbesinin üstüne detrusor kas küçük bir parça bırakın.
- 6-0 naylon iplik bir çift döngü olun, mesane hazırlık boyun etrafına yerleştirin ve döngü gevşek bırakın.
- 6-0 ipek iplik ikinci bir çift döngü ekleyin, mesane hazırlık boyun etrafına yerleştirin ve döngü kaybetmek bırakın. İki dikiş olması dikişlerin etrafındaki sızıntıları önler.
- 20 PE boru (kateter) yaklaşık 2 cm kesin, bir alev yakın ucu yavaş yavaş hareket ettirerek ucu alevlendirin.
- Kateteri sıcak (37 °C) oksijenli KBS ile doldurun.
- Kateteri mesane üretrasının deifine yerleştirin ve kateter ucu mesanenin yaklaşık ortasına ulaşana kadar kateteri yavaşça itin.
- Kateter ve mesane boynunun çevresindeki doku etrafında dikiş kravat.
- Mesaneyi yavaşça yaklaşık 50-100°L ılık (37 °C) oksijenli KBS ile doldurun, KBS yüzeyinden kısa bir süre (<10 s) kaldırın ve dikişlerde ve mesane gövdesindeki sızıntıları izleyin.
- Sızıntı gözlenmezse, deney için hazırlık hazırdır. Dikiş etrafında bir sızıntı görülürse, dikiş çıkarın ve değiştirin. Mesane gövdesinde bir delikten bir sızıntı fark edilirse, hazırlık atın.
2. Denuded Mesane Preparatının Doldurulması
- Perfuse KBS (37 °C) bir su 3 mL oda içine (37 °C) bir Sylgard alt ile ceketli organ çanak.
- Oksijen ve emme hatlarını ayarlayın.
- Denuded mesane hazırlık odasına yerleştirin.
- Preparatın perfüzyon çözeltisinin yüzeyinin üzerinde süzülmemesi için kateteri haznenin kenarına sabitle.
- Mesane kateterini aynı boyutta montaj kullanarak üç yönlü stopcock'a bağlı daha uzun bir PE20 boruya (infüzyon hattı) bağlayın.
- İnfüzyon pompası, basınç transdüser ve mesane arasındaki çizgilerin açık olduğundan emin olun.
- Infüzyon şırıngını taze, sıcak (37 °C) ve oksijenli KBS ile doldurun.
- Pompa parametrelerini ayarlayın: şırınganın türü/hacmi (yani, 1 mL), çalışma (yani aşılama), akış (yani, sabit) ve akış hızı (örn. 15 μL/dk).
- Mesane doldurmak için şırınga pompası üzerinde Başlat düğmesine basın.
- Mesane dolgusu sırasında dolum hacmini ve damar basıncını izleyin.
3. Denuded Mesane HazırlığısubU / LP Yönü Arabulucuların Tespiti
- Buz gibi mikrosantrifüj tüpler veya yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ekler içine banyo çözeltisi aliquots toplayın.
- Numuneleri uygun algılama uygulamasına göre hazırlayın ve işleyin. Pürin kullanılabilirliğinin saptanması durumunda, numuneleri HPLC ile floresan tespiti13,18ile işleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murine detrusor içermeyen mesane hazırlığı duvarı sağlamdır ve DSM ve serosa hariç tüm katmanları içerir. Prensip kanıtı çalışmaları DSM içermeyen mesane duvarında ürotelyum ve SubU/LP içerirken, tunica kaslı ve serosa nın bulunmadığını göstermiştir (Şekil 2)13.
Detrusor içermeyen mesanenin doldurulması normal mesane dolgusuna yaklaşık olarak dabur. Şekil 3, ex vivo mesane preparatlarını farklı dolum hızlarında, hacimlerde ve intraluminal basınçlarda doldurmak için deneysel kurulumun şemalarını göstermektedir. Murine ex vivo bozulmamış ve denuded mesane preparatları boşluklu basınç ulaşmak için dolgu hacimleri geniş bir yelpazede gerektirir13. Basınç hacmi ilişkileri bozulmamış ve denuded hazırlıkları(Film 1, Film 2ve Şekil 4)son derece benzer. Bu nedenle DSM'siz preparat, mesane mekanosanmı ve mekanotransdüksiyonda ürotekya ve SubU/LP rolünün fonksiyonel çalışmaları için uygundur.
Detrusor içermeyen Mesane Modelinin Olası Kullanımı
Mesane dolgusu sırasında mesane lümeni ve SubU/LP'de arabulucuların kullanılabilirliğini ölçün
Mesane preparatlarının doldurulması sırasında ekstralinal (EL; örneğin banyo SubU/LP) ve intraluminal (IL) örneklerinin toplanması için yapılan deneysel kurulum Şekil 5'tegösterilmiştir . Dolgu sırasında SubU/LP tarafında serbest bırakılan ürotelyum kaynaklı aracıların ölçümü için modelin uygunluğu pürin aracılarının salınımını ölçerek test edilmiştir (örn. adenozin 5'-trifosfat, ATP; adenozin 5'-difosfat, ADP; nikotinamid adenin dinükleotid, NAD; adenozin 5'-monofosfat, AMP; ve adenozin, ADO) çözeltide denuded preparatın SubU/LP'sini yıkar. Şekil 6 A'dagösterildiği gibi, bozulmamış DSM ile izole mesane preparatı içeren banyoda ihmal edilebilir miktarda pürin tespit edilirken, bu pürinlerin miktarları denuded mesane preparatı içeren banyodan alınan örneklerde anlamlı olarak daha yüksekti (Şekil 6B). Özellikle, lümen ve dolgu sonunda SubU/LP'den alınan örneklerdeki pürin ve metabolitlerin dağılımı önemli ölçüde farklılık göstermiştir(Şekil 6C).
Mesane dolgusu sırasında SubU/LP'deki arabulucuların ekstrasellüler metabolizmasını inceleyin
ATP, 1,N6-etheno-ATP 'nin (εATP) yüksek floresan analogunun detrusor içermeyen preparatın suburothelyal tarafına eklenmesi εATP'nin azalmasına ve εATP ürünlerinde εADP, εAMP ve εADO(Şekil 7Aa ve Şekil 7Ab)artışa yol açmıştır. Aynı şekilde, preparat lülesine εATP eklenmesi εATP'nin azalmasına ve lümende εADP, εAMP ve εADO'da artışa yol açmıştır (Şekil 7Ba ve Şekil 7Bb). Bu nedenle, model mesane dolgusu sırasında ürotelyum her iki tarafında biyoaktif arabulucuların metabolizması çalışmaları için uygundur.
Mesane dolgusu sırasında arabulucuların transurothelial naklini inceleyin
Denuded preparatın SubU/LP tarafına εATP eklenmesi, lümende εAMP, εADO ve bazı εADP'nin ortaya çıkmasıyla sonuçlanmış ve pürinlerin SubU/LP'den lümen13'e taşınabildiği düşündürmektedir (Şekil 7Ac). Aynı şekilde lümene εATP eklenmesi subu/LP13 'de εAMP ve εADO görünümü ile sonuçlanır (Şekil 7Db). ΕATP uygulamasının karşı tarafında hiçbir εATP gözlenmediğini unutmayın. Birlikte, bu gözlemler kuvvetle detrusor-free mesane hazırlık dolgu sırasında arabulucuların ikili transurothelial taşıma çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Detrusor içermeyen mesane modelinin prensibi. (A) Mesane duvarı ürotelyum, suburothelium/lamina propria (SubU/LP), detrusor kas ve serosa oluşur. Bu tabakaların her biri depolama ve idrar voiding sırasında mesane fonksiyonları için önemli olan çeşitli hücre tipleri içerir. Mesane dolumu sırasında, biyolojik olarak aktif mediatörler mesane lümeniçine ürotelyum dan serbest bırakılır ve SubU / LP mesane duvarında derin hücreleri etkilemek için, detrusor kas dahil. Mesane lümenine erişim nispeten basit olmakla birlikte, mesane duvarındaki hücreleri etkileyebilecek ürotelyum kaynaklı aracıları tespit etmek ve detrusor kas uyarılabilirliğini kontrol etmek için dolgu sırasında SubU/LP'ye doğrudan erişim yoktur. (B) Serosa ile birlikte detrusor kas tabakalarının çıkarılması SubU/LP'nin tüm yüzeyini ortaya çıkarır ve mesane dolgusu farklı aşamalarında ürotelyum kaynaklı sinyal moleküllerinin ölçülebileceği SubU/LP'ye doğrudan erişim sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Murine histolojisi bozulmamış ve detrusor içermeyen mesane duvarları. Masson'un dolgusuz (A)ve detrusor içermeyen (B)mesane duvarlarının trikrom boyaması, denuded preparatın sağlam ürotelyum (U) ve SubU/LP içerdiğini, ancak detrusor kası (D) ve serosa (S) içermediğini göstermektedir. L, lümen. Bu rakam önceki bir yayın13çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ex vivo mesane preparatlarının doldurulmasında kullanılan deneysel kurulumun şematik gösterimi. Ex vivo bozulmamış veya denuded idrar kesesi (UB) preparat ılıma yerleştirilir (37 °C) oksijenli Krebs-bikarbonat çözeltisi ile perfüzyon su ceketli organ odasına (KBS, 37 °C, pH 7.4). Mesane preparatı farklı dolum hızlarında ve hacimlerde KBS ile aşılanır ve intraluminal mesane basıncı (BP) deney boyunca kaydedilir Bu rakam önceki bir yayından çoğaltılmıştır13. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bozulmamış ve detrusor içermeyen preparatlarda basınç-hacim ilişkileri. (A) ve (B), 15 μL/dk'da Krebs-bikarbonat solüsyonu ile doldurulan ekstremite bozulmamış ve denuded mesane preparatlarının intravenöz hacim ve basıncının temsili kayıtlarıdır. Beklendiği gibi, bozulmadan hazırlayıcı nın varlığı nedeniyle geçici kasılmalar (TCs) gelişmiştir. Buna karşılık, denuded hazırlık TCs yoktu. (C) ve (D) gelişmiş ve denuded mesane preparatları basınç-hacim ilişkilerinin özet verileri göstermek için bu çözelti >250 μL barındıran. Dolgu hacimleri ve intravenöz basınçlar bozulmamış ve denuded mesane preparatlarında son derece benzer olduğunu unutmayın. Bu rakam önceki bir yayın13çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: SubU/LP'de ürotelyum türetilmiş mediatörlerin ve dolgu sırasında lümenin kullanılabilirliğini değerlendirmek için kullanılan izole mesane modelinin şematik diyagramı. Mesane hazırlığı su ceketli bir odaya yerleştirilir ve oksijenli Krebs bikarbonat çözeltisi (KBS) ile süperfüzyon. İdrar kesesi (UB) preparatısı, üretradaki bir infüzyon pompasına bağlı bir kateter aracılığıyla sıcak oksijenli KBS ile doldurulur. Mesane basıncı (BP) mesane dolgusu sırasında infüzyon hattı üzerinden üç yönlü konektör ile izlenir. Ekstralinal (EL, organ banyosu) ve intraluminal (IL) çözeltilerinden alınan numuneler, tespit uygulamalarına göre arabulucuların (m) tespiti için işlenir. Bu rakam önceki bir yayın13çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Detrusor içermeyen mesane hazırlığı, dolgu sırasında SubU/LP'deki arabulucuların kullanılabilirliğini ölçmek için uygundur. Temsili kromatogramlar, ekstraluminal numunelerde safinlerin bozulmadan(A)ve detrusor içermeyen (B) mesane preparatlarında kullanılabilirliğini gösterir. Pürin arabulucularının bozulmamış preparattan daha iyi tespit edildiğini unutmayın. (C) Lümende ve denuded preparatın SubU/LP'sinde saptanan pürin havuzlarına bireysel pürinlerin göreceli katkısı anlamlı olarak farklıdır. Bu rakam önceki bir yayın13çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Detrusor içermeyen mesane hazırlığı, mesane dolgusu sırasında arabulucuların metabolizmasını ve transurothelial naklini incelemek için uygundur. (A,B) ΕATP substratı gösteren temsili kromatogramlar (Aa,Ba). Substrat SubU/LP(Ab)veya lümen(Bb) εATP azaltıldığında εADP, εAMP ve εADO ürünleri artırıldı. Bu nedenle, εATP uygulamanın her iki tarafında bozulur; ancak εATP ürünlerinin oluşumu SubU/LP ve lümende asimetriktir. ΕATP ürünlerinin εAMP ve εADO'nun, ancak substrat εATP'nin, εATP uygulamasının karşı tarafında(Ac,Bc)ortaya çıktığını unutmayın. Bu nedenle, pürinler dosyalama sırasında detrusor-free hazırlık duvarından taşınmış gibi görünüyor. Bu rakam13'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Sağlam mesane dolgusu temsili kayıt. Mesane 15 μL/dk. Video, 5 Hz'de yüklü bir çift leştirilmiş cihaz (CCD) kamera ile zum stereomikroskop kullanılarak kaydedildi; 25 mmHg intraluminal basınca ulaştıktan sonra kayıt durduruldu. Görüntünün tam süresi 64x gerçek zamanlıdır. Bu video13çoğaltılmıştır . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Video 2: Detrusor içermeyen mesane dolgusu temsili kayıt. Mesane 15 μl/dk. Video 5 Hz ccd kamera ile bir zoom stereomikroskop kullanılarak kaydedildi doldurulmuştu; 25 mm Hg intraluminal basınca ulaşıldıktan sonra kayıt durduruldu. Görüntünün tam süresi gerçek zamanlı olarak 64 kat. Bu video13çoğaltılmıştır . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mesanenin iki işlevi vardır: idrarın depolanması ve boşaltılsa. Bu fonksiyonların normal çalışması, detrusor kas uyarılabilirliğini düzenlemek için intraluminal hacim ve basıncın ve sinyallerin mesane duvarındaki hücreler den aktarılmasını uygun mekanik algılamayı gerektirir. Mesane mukozasının (ürotelyum) SubU/LP'de mesane duvarındaki çok sayıda hücre tipini etkileyen çeşitli sinyal molekülleri salarak mesane uyarılabilirliğini düzenlediğine inanılmaktadır. Şu anda, ürotelyum kaynaklı mediatörlerin karakterizasyonu girişimleri nin çoğu, fizyolojik mesane dolgusunu yeniden üretmeyen mesane preparatlarının (örn. düz mesane duvar tabakaları, mesane duvar şeritleri veya kültürlü hücreler) kullanımını içerir. Mesane dolgusu sonunda mesane lümeninde salınan arabulucuların ölçümleri, bu arabulucuların ürotelyumun karşı tarafından salınımının endikasyonu olarak sıklıkla kullanılır. Ancak, son çalışmalar arabulucuların intraluminal içeriği mesane duvarı nın derinliklerinde mevcut ne temsil etmediğini göstermektedir13. Mesane dolgusu sırasında SubU/LP'ye erişim sağlayan yeni deneysel yaklaşımlar, mesane ürotelyumu, SubU/LP ve DSM arasındaki yerel sinyal mekanizmalarının anlaşılmasını sağlamak için gereklidir.
Burada, detrusor kas dolgu sırasında SubU / LP ürotelyum serbest arabuluculara doğrudan erişim sağlamak için kaldırılır yeni bir hayvan mesane modeli göstermek13. Denuded hazırlık yakından bozulmamış mesane dolgu benzer13,18, detrusor kas eksikliği mesane dolgu sırasında ürotelyum mekanosensitive özelliklerini değiştirmez düşündüren. Hazırlık, spinal reflekslerden ve detrusor kaslardan gelen kafa karıştırıcı sinyal yokluğunda mesane üzerinde basınç-hacim çalışmalarının yapılmasını sağlar. Bu nedenle SubU/LP'de salınan aracılar sistemik etkiler veya diğer kaynaklardan kaynaklanan kontaminasyon olmadan ölçülebilir. Mesane dolgusu sırasında SubU/LP çevresine farklı hacimlerde ve basınçlarda doğrudan erişebilme yeteneği, modeli mesane dolgusu depolama ve ön voiding aşamalarında biyolojik olarak aktif arabulucuların serbest bırakılması, metabolizması ve transurothelial taşınması nı incelemek için uygun hale getirir.
Bu protokoldeki en kritik adım, ürotelyum ve SubU/LP'yi sağlam tutarken detrusor düz kasın çıkarılmasıdır. İşlem özellikle detrusor kas ve SubU / LP arasındaki gevşek bağlantı nedeniyle fare mesane basittir. Preparatlar bozulmamış mesaneler için son derece benzer basınç hacmi özellikleri ile mükemmel tekrarlanabilirlik gösterdi13. Model de detrusor kas kısmen veya tamamen kaldırılabilir hangi büyük hayvanlardan mesanelerde uygulanabilir. Örneğin, daha önce modelin Sinomolgus maymunu Macaca fasiküsi'nden mesanede çoğaltılabileceğini ve13.
Bu ex vivo modelin potansiyel sınırlama hazırlık gücü çok konudur, özünde, merkezi sinir sistemi ve dolaşım sistemik etkilerin eksikliği mesane dolgusırasında mukoza-detrusor bağlantısının lokal mekanizmalarının ayrıntılı incelenmesine olanak sağlar . Sistemik etkilerin eksikliği izole mesane duvar levhaları veya şeritler veya kültürlü ürotelyal hücreler de dahil olmak üzere çok sayıda ex vivo yaklaşımlar ile paylaşılır. Detrusor içermeyen mesane modeli, ancak, mesane dolgu seyri subu / LP doğrudan erişim sağlar üroteklial araştırmalarda yukarıda belirtilen yaklaşımlardan daha üstündür. Bu nedenle, bu yaklaşımın kullanımı mesane nin doldurulması sırasında ürotelyum kaynaklanan mekanotransdüksiyon mekanizmalarının anlaşılmasını artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışmanın bazı bölümleri daha önce Journal of Physiology dergisinde (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Wiley and Sons, Inc. tarafından bu yayındaki materyallerin kullanımı için izin verilmiştir. Yazarların ifşa etmesi gereken herhangi bir mali veya başka çakışma yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Diyabet Enstitüsü ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Hibe DK41315 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A.
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
