Summary
تصف هذه الطريقة استخدام نموذج الماوس R26R (الحلويات) لدراسة الانسجه المعدنية ، والتي تغطي جميع الخطوات من استراتيجية التكاثر إلى acquirements الصورة. وشملت هو بروتوكول العامة التي يمكن تطبيقها علي جميع الانسجه الرخوة وبروتوكول تعديل التي يمكن تطبيقها علي الانسجه المعدنية.
Abstract
وصف خليه فرديه في الجسم لرصد أنواع الخلايا التي يمكن ان تؤدي إلى وتتبع هجرتها من خلال الكائن الحي أو تحديد طول العمر يمكن ان يكون وسيله قويه للكشف عن أليات لتطوير الانسجه والصيانة. واحده من أهم الاداات المتاحة حاليا لمراقبه الخلايا في الجسم المجري هو نموذج الماوس كونفيتي. ويمكن استخدام نموذج حلويات لتسميه الخلايا الفردية وراثيا في الفئران الحية مع البروتينات الفلورية المختلفة في نوع الخلية بطريقه محدده ورصد مصيرهم ، فضلا عن مصير ذريتهم مع مرور الوقت ، في عمليه تسمي التتبع الوراثية النسيلي أو تتبع سلاله الكلونال. وقد ولد هذا النموذج قبل عقد من الزمن تقريبا ، واسهم في تحسين فهم العديد من العمليات البيولوجية ، ولا سيما المتعلقة ببيولوجيا الخلايا الجذعية ، والتنمية ، وتجديد انسجه الكبار. ومع ذلك ، فان الحفاظ علي اشاره الفلورسنت حتى جمع الصور والتقاط المتزامن للإشارات الفلورية المختلفة يشكل تحديا من الناحية التقنية ، خاصه بالنسبة للانسجه المعدنية. يصف هذا المنشور بروتوكول خطوه بخطوه لاستخدام نموذج الحلويات لتحليل غضروف صفيحه النمو التي يمكن تطبيقها علي اي نسيج معدني أو غير معدني.
Introduction
الأساليب المحسنة لمراقبه سلوك الخلايا مرغوب فيها لزيادة الكفاءة التجريبية عند استخدام النماذج الحيوانية. واحده من أكثر الطرق المفيدة لمراقبه سلوك الخلية في الجسم الفيفو هو تتبع النسب الاكليليه مع سلالات الماوس مراسل متعدد ألوان1، بما في ذلك المستخدمة علي نطاق واسع R26R (القصاصات) الماوس2. من خلال وضع العلامات وراثيا الخلايا الفردية مع البروتينات الفلورية وبعد تلك الخلايا مع مرور الوقت ، وقد استخدمت الباحثين في العديد من المجالات الماوس قصاصات للكشف عن رؤى في العديد من النظم البيولوجية المختلفة.
الفار القصاصات هو نظام مراسل المستندة إلى loxP في التي Cre تعتمد الحمض النووي أعاده تركيبه يسبب التعبير الدائم لأحد العديد من البروتينات الفلورية المحتملة في الطريقة العشوائية2. وتشمل اليل R26R التي أعرب عنها بشكل مطلق المروج cagg ، والتي تقع علي الفور من المنبع loxp-الجددالذي يحيط كاسيت2، الذي تسلسل الادننه ينهي النسخ3، تليها بريقوس 2.1 بناء4. التالي ، فان أعاده الدمج بوساطة Cre تؤدي في وقت واحد إلى الوصول إلى الكاسيتالجديدويؤدي إلى إنتاج بعض البروتينات الفلورية اعتمادا علي اي أجزاء من البناء ال2.1 الذي يتم استئصاله. هذه الميزة يجعل الماوس كونفيتي قابله للتكيف للغاية لأنه يمكن استخدامها لاستهداف اي السكان الخلوية في الماوس الذي سلاله Cre محدده متاحه. عبور سلاله Cre الانسجه الخاصة مع سلاله R26R-الحلويات يوفر خصوصية الوسم. ومع ذلك ، ينبغي أيضا ان تكون سلاله Cre محرض (علي سبيل المثال ، CreERT أو CreERT2 ، والتي تتطلب ملزمه تاموكسيفين للسماح لهم بدخول النواة والحث علي أعاده دمج الحمض النووي5) بحيث يمكن تحقيق الوسم في نقاط زمنيه محدده. التالي ، يمكن تسميه السكان الخلوية عن طريق حقن الناتجة CreERT ايجابيه/قصاصات اليد الايجابيه مع تاموكسيفين في الوقت المطلوب نقطه وتعقبها إلى سن معينه ، عندما يمكن جمع انسجه الفائدة للتحليل. بعد معالجه الانسجه ، يمكن تصور الخلايا فلوريسسينتلي المسمية مباشره بواسطة المجهر البؤري بحيث يمكن فصل ذريه كل خليه المسمية في البداية من ذريه ولدت من قبل اي خليه أخرى المسمي استنادا إلى الفلورسنت الخاصة بهم التسميات ، التالي السماح كلوليتي ليتم تقييمها (اي ، التتبع الوراثية النسيلي).
نظرا لمرونة نموذج حلويات ، وقد تم تطبيقه لدراسة تطوير وصيانة العديد من الانسجه المختلفة في مجال الصحة والمرض2،6،7،8،9، 10,11. أحدي الطرق الشائعة لاستخدام النموذج هي تسميه عدد معين من الخلايا وتحديد الانسجه التي ساهمت فيها (و/أو ذريتها). وكان أحد هذه النتائج باستخدام هذا النهج هو ان الأسنان البالغ يتكون من الخلايا مع الأصل الانحدر6. تطبيق آخر للنموذج هو دراسة التوازن الخلية الجذعية. فعلي سبيل المثال ، كشف نموذج الحلويات ان الخلايا الجذعية في الشفرات المعوية تتحول تدريجيا إلى مونوكلونال لان بعض الخلايا الجذعية المستنسخة تكون مهيمنه خلال المنافسة بين الزنزانات الجذعية2. ويمكن أيضا استخدام النموذج لتقييم تكاثر الخلايا ، وهو أمر مفيد بشكل خاص لدراسة الخلايا المنقسمة ببطء. علي سبيل المثال ، تم تقييم تشكيل النسيلي في الغضروف المفصلي12 ، ودرست الآثار قصيرة الأجل من خصم القنفذ علي لوحه النمو غضروفي في الفئران القديمة خمسه أسابيع13.
وعلي الرغم من البساطة النسبية لنموذج الحلويات ، فان اشاره الفلورسنت يمكن ان تكون صعبه من الناحية الفنية للمحافظة عليها حتى جمع الصور ، وخاصه عند تحليل الانسجه المعدنية. هنا ، يصف البروتوكول نموذجا محسنا لاستخدام الماوس قصاصات مع العظام بعد الولادة (حتى 6 أشهر من العمر) ، وتمكين البروتينات الفلورية لتكون تصور مباشره من قبل المجهر البؤري دون الحاجة إلى المناعة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول المبسط علي الانسجه غير المعدنية. وعلاوة علي ذلك ، وشملت وصفا لكيفيه تخزين العينات من أجل الحفاظ علي اشاره الفلورسنت لفتره طويلة من 3 سنوات علي الأقل. ويرد في الشكل 1موجز للبروتوكول.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع اعمال الفاره من قبل اللجنة الاخلاقيه للتجارب الحيوانية (لجنه ستوكهولم الشمالية/Norra Djurفورسksetiska Nämd) وأجريت وفقا لاحكام وكاله الحيوانية السويدية والمبادئ التوجيهية للتجارب الحيوانية.
1. الماوس تربيه
- لتوليد سلاله ، عبر الماوس R26R-الحلويات مع خط Cre من الفائدة. وين الصغار في 21 يوما من العمر.
ملاحظه: يمكن استخدام الفئران للتربية من حوالي 8 أسابيع من العمر ، أو وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية. يمكن اجراء التنميط الجيني (غير موصوف هنا) من الخزعات التي يتم جمعها عند الفطام. ويمكن تعديل سن الفطام وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية.
2. الملصقات الحلويات
ملاحظه: هذه الاستراتيجية وضع العلامات المناسبة لسلالات Cre تاموكسيفين المحرض.
- اعداد حل يصل إلى 2.5 ملغ/مل تاموكسيفين في زيت الذرة في زجاجه. تذوب عن طريق التسخين إلى 37 درجه مئوية في فرن لمده تصل إلى 60 دقيقه ، والتحريض كل 5 دقائق باستخدام دوامه حتى يذوب مسحوق.
ملاحظه: للحصول علي جرعات متزايدة من تاموكسيفين ، يمكن اعداد حلول تصل إلى 20 مغ/مل باستخدام هذه الطريقة. - يخزن في 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر ، محمي من الضوء.
- الحث علي أعاده الدمج من خلال أداره 50 μL من 2.5 ملغ/مل تاموكسيفين المذاب في زيت الذرة داخل الصفاق في اليوم الأول بعد الولادة (P1).
ملاحظه: من حيث المبدا ، يمكن ان تدار تاموكسيفين في اي عمر ، في وقت مبكر من جيل F1. وينبغي ان تختلف الجرعة من تاموكسيفين استنادا إلى التعبير Cre, عمر الماوس, والتطبيق التجريبي. ويمكن الاطلاع علي مزيد من المعلومات في قسم المناقشة. الفئران السلبية cre التعامل بنفس الطريقة يمكن استخدامها كعنصر تحكم سلبي للإشارات الفلورسنت الحلويات.
تحذير: ضمان معالجات الحيوانية وحذر من استخدام تاموكسيفين والتاكد من ان يتم التخلص من المواد قفص وفقا للمبادئ التوجيهية البيئية والسلامة المحلية.
3. جمع الانسجه
- موت ببطء الفئران في اليوم التالي للولادة 27 (P27) من خلال ملء تدريجيا الفضاء التي تحتوي علي الفئران مع ثاني أكسيد الكربون تصل إلى ما لا يقل عن 80 ٪ من حيث الحجم والحفاظ علي هذا التركيز لمده 3 دقائق. أداء خلع عنق الرحم. إبقاء الفئران علي الجليد خلال تشريح الكائنات الأخرى.
- تشريح الانسجه من الفائدة. ويرد أدناه بروتوكول لجمع الظنبوبي القريبة ولوحات النمو الفخذي البعيدة والغضروف المفصلي في الركبة ، ومناسبه للفئران بعد الولادة حتى سن 6 أشهر.
- أزاله الجلد حول الأطراف الخلفية بقدر القدم ، وذلك باستخدام مقص حاد وملقط مسننه.
- تقريبا تقليم العضلات والانسجه الدهنية من الساقين مع مقص حاد.
ملاحظه: لا تنظف العظام تماما ، لان الانسجه المحيطة توفر بعض الدعم الهيكلي عند السحب ، ولكن تاكد من أزاله جميع الجلد. - باستخدام مشرط ، وقطع من خلال الانسجه الرخوة حيث الجزء العلوي من الساق يلتقي الجسم حتى راس الفخذ مرئية ، ثم قطع الاربطه في مفصل الورك لأزاله الساق.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، إذا لم يكن من الممكن العثور علي راس الفخذ ، وقطع من خلال عظم الفخذ بالقرب من الورك مع مقص قوي. - تشريح القدم من بقية الساق باستخدام مشرط أو مقص حاد.
4. تثبيت الانسجه ومعالجهها
ملاحظه: استنادا إلى الانسجه من الفائدة ، اتبع أحد البروتوكولين المفصلة أدناه (4.1 للانسجه الرخوة أو 4.2 لأنسجه الفئران المعدنية علي مدي عمر حوالي 45 يوما ، كما هو مفصل أدناه). لكلا الأسلوبين ، تخزين العينات تشريح في 3.7 ٪ الفورمالديهايد/الفوسفات مخزنه المحلول الملحي (تلفزيوني) علي الجليد في حين تشريح الكائنات المتبقية.
- للانسجه الرخوة و tibiae المعدنية و femora حتى سن ما يقرب من P45 ، إصلاح الانسجه في precooled 3.7 ٪ الفورمالديهايد/برامج تلفزيونيه ل 6 ح ، المتداول بلطف علي المدور في 4 درجه مئوية. استخدام وحده تخزين علي الأقل 10x أكبر من ذلك من الانسجه. تابع مباشره إلى الخطوة 4.3.
- للانسجه المعدنية ، بما في ذلك tibiae و femora فوق سن P45 تقريبا ، مطلوب خطوه الكلس.
- اعداد 1 لتر من 10 ٪ أدتا/dH2O الحل مع درجه الحموضة تعديلها إلى 8.05 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. المقبل ، تمييع الفورمالديهايد إلى 3.7 ٪ باستخدام هذا الحل. سيكون تركيز العمل من أدتا 9 ٪.
- إصلاح الانسجه عن طريق وضع في precooled 3.7 ٪ الفورمالديهايد/التلفزيونية بين عشيه وضحيها ، والمتداول بلطف علي المدور في 4 درجه مئوية.
- وضع الانسجه في precooled 3.7 ٪ الفورمالديهايد/9 ٪ أدتا/dH2O الحل (pH 8.05) ، وتناوب بلطف في 4 درجه مئوية في حجم ما لا يقل عن 10x أكبر من ذلك من الانسجه. كرر هذه الخطوة عن طريق وضع العظام في الطازجة ، precooled 3.7 ٪ الفورمالديهايد/9 ٪ أدتا/dH2O ل 3x علي مدي 48 h المقبل.
ملاحظه: هذا الكلس القصير هو ما يكفي للسماح لتقطيع عظم الفخذ وعظام الساق تصل إلى 6 أشهر الفئران القديمة. لمزيد من الانسجه المعدنية الكثيفة قد تكون هناك حاجه إلى مزيد من الكلس لتحسين الانسجه.
- نقل الانسجه إلى precooled 30 ٪ السكروز/dH2س. تاكد من ملء الحاوية إلى حافه ، وتناوب بلطف بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. استخدام وحده تخزين علي الأقل 10x أكبر من ذلك من الانسجه. وغالبا ما تطفو الانسجه عند وضعها لأول مره في هذا الحل وتغرق إلى أسفل الزجاجة في الصباح.
- لأزاله محلول السكروز المتبقية ، وغسل لفتره وجيزة الانسجه عن طريق ازالته من محلول السكروز مع ملقط وتغطي تماما العينة مع ما يقرب من 5 مل من مركب درجه حرارة القطع الأمثل (OCT) لعده ثوان.
- ملء السابقة المسمية بالبرد مع OCT ووضع الانسجه في الجزء السفلي. العمل بسرعة لتجنب العينات الجلوس في درجه حرارة الغرفة لفتره طويلة جدا.
ملاحظه: من المهم وضع العينة في اتجاه مناسب لخطوه التوجيه. لزيادة فرص التقطيع من خلال أعمده لوحه النمو بأكملها بعد التتبع مع Col2CreERT: حلويات ، ضع الجانب الإنسي الذي يواجه أسفل باستخدام راس الفخذ كدليل ، ووضع العينة كمسطحه إلى أسفل القالب قدر الإمكان. - تضمين العينة عن طريق وضع العفن علي الجليد الجاف والانتظار لل OCT ليصلب تماما. وضع الأطفال الباكيين مسطحه قدر الإمكان لتجنب حركه/انزلاق الانسجه في القالب. بمجرد الانتهاء ، وتخزين العينات في-20 درجه مئوية ، إذا لم يتم استخدامها علي الفور.
ملاحظه: استخدام في غضون 12 أسبوعا ، لأنه مع العمر الكتل تصبح أكثر صعوبة للقسم.
5. التقسيم
ملاحظه: اجراء العمليات باستخدام التبريد مع شفرات المتاح مناسبه للانسجه الصلبة. اي التبريد القياسية هي مناسبه.
- أزاله كتله من العفن وتامينه لتشاك من خلال تطبيق OCT بين الأعلى من كتله وتشاك والتبريد في البرد في-20 درجه مئوية لمده 5 دقائق علي الأقل ، بحيث قد وطدت تماما OCT.
- Precool كل من حامل العينة وحامل نصل إلى-20 درجه مئوية ومن ثم وضع عينه/تشاك في حامل تشاك وشفره في حامل شفره لتتوازن لعده دقائق.
ملاحظه: قد تختلف درجات الحرارة المحددة عده درجات اعتمادا علي البرودة والانسجه من الفائدة. - استخدام التبريد لتقليم كتله وقطع الانسجه أجزاء من سماكه مناسبه للسماح للتصوير التصويري في الانسجه من الفائدة.
- لتحليل لوحه النمو بعد الولادة ، اعداد أقسام من 30 − 160 μm وجمعها علي الشرائح. قد تسمح بعض نماذج التبريد فقط بتجميع المقاطع السميكة باستخدام اعداد القطع.
- الهواء يجف الشرائح في درجه حرارة الغرفة حتى انها جافه تماما.
ملاحظه: يمكن ان تختلف مده هذه الخطوة استنادا إلى خصائص الانسجه وسمك المقطع. درجه حرارة الغرفة من المحتمل أيضا ان تؤثر علي سرعه هذه الخطوة. - تخزين الشرائح في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 36 أشهر ، أو في حاله المعالجة فورا ، انتقل إلى الخطوة 6.2.
6. اعداد الشريحة وتصاعد
- قم بازاله الشريحة من الفريزر وإحضارها إلى درجه حرارة الغرفة أفقيا في حامل الشريحة. السماح لأي تكاثف لتتبخر.
- أزاله OCT باستخدام ماصه باستور لتطبيق بلطف تلفزيوني في درجه حرارة الغرفة علي الشريحة. وكلما كان المقطع أكثر سمكا ، يلزم وقت أطول. بالنسبة للأقسام السميكة 160 μm ، قم باجراء اثنين من الشطف: احتضان مره واحده لمده 15 دقيقه وأزاله السائل ، ثم تطبيق تلفزيونيه جديده لمده 5 دقائق وأزاله السائل.
ملاحظه: هذه الخطوة هي لأزاله OCT ويمكن ان تكون متنوعة استنادا إلى خصائص الانسجه وسمك القسم ، حسب الاقتضاء. درجه حرارة الغرفة من المرجح ان تؤثر علي سرعه هذه الخطوة. - جبل الشرائح في محلول من 75 ٪ 2 ، 2-ثيوديايثانول/dH2س في درجه حرارة الغرفة مع 60 مم تغطيه طويلة زلة.
ملاحظه: يمكن اعداد الشرائح مباشره قبل التصوير ، ولكن الاشاره الفلورية مستقره لمده 1 − 2 أسابيع إذا تم الاحتفاظ بها خارج الضوء في غرفه مرطبه عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
7. التصوير عن طريق المجهر البؤري
- قم باعداد المجهر.
- تشغيل المجهر وفتح البرنامج. انقر فوق الزر " بدء النظام ".
- حدد القناات من خلال النقر أولا فوق الاعداد الذكي ضمن علامة التبويب الاستحواذ ثم تحديد القناات الثلاث المقابلة للبروتين الفلوري الأحمر (العروض) والبروتين الفلوري الأصفر (yfp) والبروتين الفلوري السماوي (بالفرنك الباسيفيكي) تحت صبغ العنوان. انقر فوق أفضل اشاره ثم تطبيق لتحديد الليزر.
ملاحظه: يتم عرض محتويات علامة التبويب الاستحواذ في الملف التكميلي 1a. إذا لم تكن القناات المطلوبة موجودة ، قم بإضافتها باستخدام الزر"+" تحت عنوان الصبغة . يتم عرض المعلومات اللازمة فيما يتعلق بالليزر ، وأطوال موجية الاثاره ، ومجموعه من موجات الانبعاثات المسجلة للبروتينات الفلورية الثلاثة في الملف التكميلي 1B-D. - حدد العدسة الموضوعية 20x تحت عنوان الهدف في علامة التبويب وضع الامتلاك .
- حدد موقع لوحه النمو أو الانسجه الأخرى التي تهمك.
- لتوفير طريقه عرض مميزه ، قم أولا بتحديد قناه عروض التقديم بالنقر علي اسمها في علامة التبويب القناات . يؤدي ذلك إلى عرض تفاصيل قناه عروض التقديم في علامة التبويب مسار الضوء . انقر فوق مربع الاختيار بجانب T-pmt.
ملاحظه: تظهر قناه T-PMT ضوء ليزر غير منعكس ، والذي يستخدم لتصور الأجزاء غير الفلورية من الانسجه. - ضع الشريحة في حامل الشريحة وضع لوحه النمو أو الانسجه الأخرى ذات الاهتمام مباشره بين المسار الضوئي والعدسة الموضوعية.
- من أجل تبسيط إضفاء الطابع الخاص علي الانسجه ، قم بإلغاء تحديد قنوات YFP و القناات الباسيفيكية باستخدام صناديق القراد تحت عنوان المسارات من علامة التبويب القناات .
- حدد قناه T-PMT بالنقر فوق اسمها في عنوان المسارات . انقر فوق Live في علامة التبويب الاستحواذ وزيادة الكسب (الرئيسي) للقناه T-pmt من أجل تصور القسم الانسجه علي الشاشة ، والذي يظهر في التدرج الرمادي.
- حرك موضع الشريحة باستخدام عصا التحكم لتحديد منطقه الاهتمام ، ثم التركيز باستخدام مقبض المجهر المناسب.
- انقر فوق إيقاف في علامة التبويب الاستحواذ لإيقاف التعرض لأشعه الليزر.
- لتوفير طريقه عرض مميزه ، قم أولا بتحديد قناه عروض التقديم بالنقر علي اسمها في علامة التبويب القناات . يؤدي ذلك إلى عرض تفاصيل قناه عروض التقديم في علامة التبويب مسار الضوء . انقر فوق مربع الاختيار بجانب T-pmt.
- تحديد معلمات التصوير.
- استخدم مربعات الاختيار في علامة التبويب القناات لتحديد أحدي القناات وانقر علي Live في علامة التبويب الاستحواذ لعرض صوره تلك القناة علي الشاشة. ثم ، وذلك باستخدام زر الأيسر علي الماوس ، وضبط الشريحة القضبان لتعيين نطاق اشاره الفلورسنت المنبعثة التي يتم جمعها ، وقوه الليزر (انزلاق شريط تحت الليزر العنوان) ، وكسب (ماجستير) وأزاحه الرقمية في تبويب القناات لتصور الخلايا المسمية بقصاصات الورق علي الشاشة. يتم توفير قيم المبادئ التوجيهية لجميع هذه المعلمات في الملف التكميلي 1B-D لتقديم العروض ، yfp ، والباسيفيكي. أكمل هذه الخطوة لكل قناه ، واحدا تلو الآخر.
ملاحظه: للتاكد من ان الاشاره المتصورة ليست تلقائيا ، يمكن استخدام مقطع من الحيوانية السالبة Cre كعنصر تحكم سلبي اثناء هذه الخطوة. كما تم الجمع بين T-PMT مع الليزر لعروض العروض (الخطوة 7.2.1) تعديل قوه الليزر لعروض العروض سوف تؤثر علي اشاره T-PMT. - ضبط حجم الثقب لزيادة الكشف عن الفلورية إذا لزم الأمر.
ملاحظه: كلما ارتفع حجم الثقب ، يتم الكشف عن المزيد من اشاره الفلورسنت في الاتجاه Z. وهناك مبدا توجيهي لهذا هو وحده مهواه الناتجة (الاتحاد الافريقي) ، والتي يشار اليها تلقائيا تحت مؤشر الثقب ، حيث 1 الاتحاد الافريقي هو الأمثل لجوده التصوير. زيادة الاتحاد الافريقي أكثر من اللازم سوف يضعف التحليل في وقت لاحق لأنه يصبح أكثر صعوبة للتمييز بين الخلايا الفردية في الاتجاه Z). - تحقق من الاعداد للتاكد من ان الإشارات المسجلة لا تتداخل.
- انقر علي مربعات الاختيار في علامة التبويب القناات لتحديد جميع القناات الثلاث واضغط علي زر الانجذاب في علامة التبويب الاستحواذ .
- في الصورة الناتجة ، قم بالتمرير بين القناات المعروضة بالنقر فوق المربعات المميزة باللون الأزرق اعلي كل قناه مدرجه في علامة التبويب الابعاد . التحقق يدويا من وجود تداخل بين القناات الموجودة علي الشاشة. إذا كانت الإشارات تتداخل (علي سبيل المثال ، إذا كانت كل خليه حمراء أيضا صفراء) ، فارجع إلى بداية الخطوة 7.3 وكرر ، واضبط المعلمات للقنوات المتداخلة حتى يمكن تمييزها عن بعضها البعض. تاكد من انه بالنسبة لكل تصنيف (اي ، عروض العروض ، YFP ، أو الباسيفيكي) ، يمكن تصور استنساخ واحد علي الأقل يحتوي علي واحده فقط من التسميات.
- استخدم مربعات الاختيار في علامة التبويب القناات لتحديد أحدي القناات وانقر علي Live في علامة التبويب الاستحواذ لعرض صوره تلك القناة علي الشاشة. ثم ، وذلك باستخدام زر الأيسر علي الماوس ، وضبط الشريحة القضبان لتعيين نطاق اشاره الفلورسنت المنبعثة التي يتم جمعها ، وقوه الليزر (انزلاق شريط تحت الليزر العنوان) ، وكسب (ماجستير) وأزاحه الرقمية في تبويب القناات لتصور الخلايا المسمية بقصاصات الورق علي الشاشة. يتم توفير قيم المبادئ التوجيهية لجميع هذه المعلمات في الملف التكميلي 1B-D لتقديم العروض ، yfp ، والباسيفيكي. أكمل هذه الخطوة لكل قناه ، واحدا تلو الآخر.
- الحصول علي الصورة.
- حدد علامة التبويب وضع الاستحواذ لتحديد جوده الصورة باستخدام حجم الإطار، والسرعة ، ومتوسط القيم الرقمية .
ملاحظه: يتم الاشاره إلى الإعدادات النموذجية لهذه التجارب في الملف التكميلي 1A. تقليل التكبير/التصغير تحت عنوان منطقه المسح الضوئي ضمن علامة التبويب الاستحواذ يمكن زيادة حقل العرض دون تغيير الوقت المطلوب للحصول علي الصورة. - في علامة التبويب الاستحواذ ، تحت عنوان الاستحواذ الابعاد ، انقر فوق مربع الاختيار المكدس Z . افتح علامة التبويب z-المكدس لتعيين الفاصل الزمني بين الصور في الاتجاه z إلى 2.5 μm.
- لتعيين المواقع الصحيحة ، حدد فقط عرض التقديم/T-PMT في علامة التبويب القناات وانقر علي Live لتصور المستنسخين الأحمر مع مخطط مرئي للانسجه. تعيين الشريحة الاولي والاخيره بالنقر فوق تعيين الأول وتعيين الماضي علي شريحة المقابلة ، وضبط التركيز باستخدام مقبض المجهر.
- انقر فوق علامة تبويب المسح الضوئي تجانب ضمن علامة التبويب الاستحواذ وادخل العدد الإجمالي للبلاط في الاتجاات الافقيه والعمودية في المربعات المعنية.
- للتقاط الصور ، حدد جميع القناات المطلوبة في علامة التبويب القناات ، ثم انقر علي زر الانجذاب لجمع صوره واحده ، أو زر بدء التجربة لجمع فحص Z مكدس/تجانب.
- حدد علامة التبويب وضع الاستحواذ لتحديد جوده الصورة باستخدام حجم الإطار، والسرعة ، ومتوسط القيم الرقمية .
- بمجرد الحصول علي الصورة ، انقر فوق ملف ثم حفظ باسم وحفظ الصورة في نوع الملف الذي يحفظ الكثير من المعلومات حول إعدادات المجهر قدر الإمكان ، للسماح للمراجعة وأعاده استخدامها في وقت لاحق.
- اجراء المزيد من التحليل باستخدام برنامج تحليل الصور.
Representative Results
لتسميه غضروفي في الغضروف الغضروفي وتصور توسعها النسيلي مع العمر باستخدام الاداره تاموكسيفين علي P1, Col2CreERT: تم وصفها الفئران قصاصات, وجمعت أطرافهم الخلفية علي P27. تم تحديد القسم المركزي من خلال تصور الرباط الصليبي (الشكل 2 ا) وتم تصور المستنسخات في لوحه النمو الظنبوبي القريبة (الشكل 2 ب). وتظهر هذه البيانات ان الخلايا الفردية التي كانت Col2 الايجابيه علي P1 وأصبحت المسمية مع البروتينات الفلورية كونفيتي عندما تدار تاموكسيفين, خضع التوسع النسيلي, وبقي بعد ذلك في لوحه النمو حتى P27. ويمكن النظر إلى التغيرات الاوليه في التوسع التاجي من نقطه زمنيه انمائيه مماثله في الشكل 1 من منشور صدر مؤخرا في13.
لإعطاء مثال علي اشاره الفلورسنت بعد التخزين طويل الأجل (الخطوة 5.5) ، تم تخزين القسم الذي تم جمعه مباشره بعد (انظر الشكل 2ا ، ب) لأكثر من 3 سنوات قبل ان يتم اعداده والتصوير (الشكل 2c، الفيديو 1) .
لإظهار بعض المشاكل الشائعة مع البروتوكول ، يتم عرض مقطع مكسور اثناء الخطوة الخاصة بالتجميد في الشكل 3A. منطقه القسم (بين لوحه النمو والغضروف المفصلي) الموسعة في الشكل 3b يظهر ان هذه الجرعة من تاموكسيفين يؤدي إلى مثل هذا المستوي العالي من أعاده الدمج في هذا المجال انه سيمنع تحليل النسيلي.
الشكل 1: نظره عامه تجريبية. مخطط انسيابي يلخص المراحل الرئيسية للأسلوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور القصاصات من الماوس Col2CreERT: القصاصات. (ا) عينات من Col2CreERT: تمت معالجه الفئران الحلويات دون التكلس أو خطوه التخزين علي المدى الطويل. ويقع القسم المركزي باستخدام الرباط الصليبي كعلامة. تم تصور هذه الصورة باستخدام فحص البلاط بعد الكشف عن عروض العروض مع T-PMT (شريط مقياس = 300 μm). (ب) تظهر الاعمده الكلناله داخل القصبة القريبة من لوحه النمو المرئية في (ا) ، بعد أعاده البناء ثلاثية الابعاد. (ج) تم تجهيز شريحة مجاوره لتلك المبينة في الشكلين (ا) و (ب) المحتفظ بها في التخزين طويل الأجل لأكثر من 3 سنوات لأغراض التصوير وأعاده البناء الثلاثي الابعاد. يتم عرض عروض العروض ، YFP ، والباسيفيكي في (B) و (C) (القضبان مقياس = 50 μm). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحديات عند استخدام الأسلوب. (ا) خطوط متقطعه بيضاء مخطط تقسيم في القسم من خلال لوحه النمو من Col2CreERT: الفئران قصاصات (مقياس شريط = 50 μm). تظهر المنطقة الموجودة داخل المربع الأبيض في (B) (شريط المقياس = 25 ميكرومتر). يتم عرض عروض العروض ، YFP ، والاشعه فوق المتوسطة في كلا اللوحتين ، كما تظهر قناه ضوء الليزر غير المنعكسة (T-PMT) في (ا) لتصور الانسجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: أعاده بناء ثلاثية الابعاد للوحه النمو من Col2CreERT: الفار القصاصات. شريحة أعدت من Col2CreERT: تم عقد الماوس القصاصات في التخزين علي المدى الطويل بعد الفصل لأكثر من 3 سنوات ، ومن ثم معالجتها للتصوير. وأجريت أعاده البناء ثلاثية الابعاد تلقائيا مع برامج تحليل الصور وتصديرها كفيديو. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
الملف التكميلي 1: التشكيل النموذجي للمجهر البؤري. (ا) الضوابط الرئيسية الموجودة في علامة التبويب الاستحواذ . (ب−د) وتظهر معلمات الليزر ، والطول الموجي الاثاره ، ومجموعه من موجات الانبعاثات المسجلة لثلاثه البروتينات الفلورية قصاصات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
تم استخدام نموذج الحلويات علي نطاق واسع لدراسة انسجه الغضروف المعدنية12،13،14 ولوصف البروتوكول الأمثل. يمكن استخدام الفئران قصاصات2 مع نسخه واحده أو نسختين من اليل R26R-الحلويات لتربيه والتجارب. أعاده الدمج في الفئران مع اليل واحد من بناء 2.1 الدماغ سيعطي أربعه التسميات المحتملة: البروتين الفلوري الأحمر (تقديم العروض ، سيتوبلازمي) ، البروتين الفلوري الأصفر (yfp ، سيتوبلاسولي) ، البروتين الفلوري السماوي (الباسيفيكي ، غشاء المترجمة) ، والأخضر البروتين الفلوري (GFP ، النواة المترجمة) ، في حين ان أعاده الدمج في الفئران المحتوية علي الورق (اي ، تحتوي علي نسختين من البناء 2.1 الدماغ) سوف تعطي 10 مخرجات اللون المحتملة (عروض التقديم + العروض ، العروض + YFP ، عروض التقديم + الباسيفيكي ، العطاء + GFP ، yfp GFP, س ف ب + اف بي اي, اف بي + GFP, GFP + GFP. ومع ذلك ، لان الختان الحمض النووي والاحداث الانقلاب تحدث بطريقه عشوائية ، أعاده تركيب لإنتاج GFP يحدث في جزء صغير فقط من الخلايا ، كما ذكرت سابقا2، ويختلف علي ما يبدو من نوع الخلية أو خط cre المستخدمة2، 12,13. التالي ، نظرا لانخفاض حدوث الاحداث المعاد تجميعها مما يؤدي إلى التعبير GFP ، وسته مخرجات اللون هي الأكثر شيوعا في الفئران الحلويات المنزلية.
اعتبار مهم عند التخطيط للتجارب مع الماوس قصاصات هو العثور علي سلاله Cre مناسبه. أولا ، نظرا لان اليل الحلويات لديها العديد من مواقع loxp ، واحده الحدث أعاده اتحاد لا يستبعد الثاني4. وهذا يعني انه إذا تم تسميه خليه ويقسم لإنتاج نسخه من لون واحد ، حدث أعاده تركيب الثانية في واحده من خلايا ابنتها من شانه ان يولد لون مختلف ، التالي إخفاء التوسع الحقيقي النسيلي. التالي ، سلالات Cre لا يمكن الحث ، حيث يكون الانزيم نشطا دائما إذا كان المروج المطابق نشطا ، ليس من المستحسن. ثانيا ، في بعض السلالات التعبير من cre للالطبيعيه غالبا ما ياتي علي حساب البروتين الذاتية ، التالي خلق النمط الظاهري من تلقاء نفسها (علي سبيل المثال ، ل Prg4-GFPCreERT2 ضرب في سلاله الماوس التي الفئران الميناء اثنين من الاليلات15) ، لذلك نسخه واحده من اليل cre هو مرغوب فيه. وفي جميع التجارب الموصوفة ، حملت نسخه واحده من الCol2CreERT16 اما الذكر أو الام الأنثى لتوليد Col2CreERT: الفئران الحلويات ، كما هو موضح في13. بعد ذلك ، فان خصوصية خط Cre إلى نوع الخلية من الفائدة هو اعتبار هام. علي سبيل المثال ، Col2CreERT هو غضروفي ، ولكن تسميات العديد من السكان متميزة من الغضروفي في الغضروف بعد الولادة في وقت مبكر17. وأخيرا ، فان نشاط سلالات Cre مختلفه يمكن ان تتغير إلى حد كبير مع العمر الحيواني ، كما النشاط الذاتي لمروج تستخدم لتغييرات التعبير Cre ، حتى في الخلايا من نفس النوع (علي سبيل المثال ، Prg4-GFPCreERT2، والتي يمكن ان تتطلب زيادة عدد جرعات تاموكسيفين لتسميه خلايا المنطقة السطحية كما الفئران سن15).
وسوف تنعكس علي عدد من الخلايا المسمية من كميه تاموكسيفين نظرا, لذلك ليس من المرغوب فيه دائما لإعطاء الجرعة القصوى لان التمييز بين الاستنساخ من بعضها البعض قد يكون من الصعب. لان التعبير Cre سوف تختلف تحت تنظيم المروجين مختلفه وكذلك مع العمر, الجرعة تاموكسيفين سوف تحتاج إلى تعديل لتحسين وضع العلامات. ومن المهم ان نلاحظ ان الخلايا ليست علي الفور الفلورسنت عند التسبب في أعاده التركيب لان الوقت مطلوب لأعاده تركيبه لتحدث والبروتينات الفلورية الناتجة تتراكم بما فيه الكفاية للتصوير. وهناك حاجه إلى مجموعه واسعه من الساعات (بين 24 − 72 ح) ، والتي يبدو ان تتاثر خط Cre ، من نوع الخلية ، والعمر الحيواني. منذ تاموكسيفين يمكن ان تكون نشطه بيولوجيا بعد فتره طويلة من الاداره18 فمن المستحسن دائما للتحقق من كفاءه أعاده الجمع بدقه في كل نموذج.
خلال خطوه المجهر البؤري ، تتطلب أثاره البروتينات الفلورية من الورق اختراق الانسجه بواسطة ضوء الليزر. لان الانسجه المختلفة لها خصائص مختلفه ، ضوء الليزر قد لا تخترق أقسام سميكه 160 μm من جميع الانسجه. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذه الأقسام سميكه لنمو الغضروف لوحه ، كما هو مستخدم في الشكل 2، الشكل 3. لاحظ ان كل المجهر مختلفه ، وانه من غير المرجح ان الإعدادات الموصوفة (الملف التكميلي 1) سوف تعمل تماما دون تعديلات طفيفه. واحد التحديات الرئيسية هو التمييز بين البروتينات الفلورية المختلفة لضمان عدم وجود تلوث من قناه إلى أخرى. علي سبيل المثال ، الاشاره في قناه YFP الناجمة عن الفلورية القادمة من GFP تتداخل بين قنوات YFP وعروض العروض. ويجب أيضا فحص قنوات YFP و القناات الباسيفيكية بعناية. ويمكن القيام بذلك بعده طرق. أولا ، يمكن تضييق نطاق انبعاثات الموجات الضوئية الفلورية التي يتم تسجيلها لكل بروتين فلوري. ثانيا ، يمكن ضبط قوه الليزر في تركيبه مع المكسب الرقمي تحسين الاشاره. في هذه الدراسة كانت هذه الخطوات كافيه ، ولكنها تعتمد علي اشاره فلورية قويه. وهذا يعني انه من الناحية النظرية ، يمكن ان تقلل معالجه الانسجه غير الفعالة من نشاط البروتينات الفلورية ، أو يمكن ان يضعف مصدر ضوء الليزر الضعيف فصل القناة.
واحده من مزايا الماوس قصاصات هو انه يمكن الجمع بينها وبين عدد كبير من سلالات متحولة وراثيا التي تتوفر بحيث يمكن دراسة تاثير الجينات محدده علي ديناميات النسيلي10،11،12 ،13،14،19،20، وان كان مع بعض القيود. علي سبيل المثال ، لا يمكن فصل أعاده تركيب الكللات الحلويات وجين الفائدة عند استخدام المسوخ المستندة إلى Cre loxP مع تتبع النسب الكلونال. ومع ذلك ، يمكن ان تكون هذه الاحداث المتزامنة أعاده تشكيل فعاله10،14،20. علي سبيل المثال ، تم استخدام هذه الامكانيه لاستكشاف زيادة عدد الخلايا في منطقه الراحة من الفئران بعد الاستئصال بعد الولادة غضروفي محدده من TSC1 في لوحه النمو21 وكشفت العلاقة النسيلي بين هذه الخلايا مع مرور الوقت 13. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام تحليل النسيلي الانسجه الخاصة باستخدام الفئران قصاصات الورق مع الفئران متحولة غير cre loxp القائم علي11، وانه من الممكن أيضا الجمع بين هذه النهج مع الدوائية8،9 ،13 و/أو النماذج الجراحية8 لتصور الاستجابات النسيلي لاضطرابات وظيفية أخرى. المزيد من الفرص تنشا عند الجمع بين المقاطع المسمية قصاصات مع المناعة من البروتينات الذاتية عن طريق المناعي. ويسمح هذا التحليل بتحديد الخلايا المتتبعة والتنظير الحراري بعلامة معروفه. مع طريقه التثبيت الموصوفة هنا ، فمن الممكن لاجراء المناعي ولا تزال تصور الفلوري من البروتينات الفلورية قصاصات12،13. ومع ذلك ، في الورقات المذكورة ، لم يكن مطلوبا استرداد antigen. أساليب استرداد مستضد القاسية ، مثل الغليان في العازلة سيترات ، يؤدي إلى فقدان كامل من الفلورية القصاصات. علي الرغم من انه يمكن بعد ذلك الكشف عن البروتينات الفلورية كونفيتي باستخدام الأجسام المضادة22، يمكن ان يحدث فقدان الهوية النسيلي.
وباختصار ، فان استخدام نموذج الحلويات لتسميه الخلايا في الجسم الخارجي هو أداه معلوماتية لتحليل مصير تلك الخلايا مع مرور الوقت. توفر الطريقة الموصوفة طريقه سريعة وفعاله لتصور تعبير البروتين الفلوري بشكل مباشر في الانسجه المعدنية.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ايفغيني ايفاشكين علي المشورة المنهجية. وقد حظي هذا العمل بالدعم المالي من مجلس البحوث السويدي (ا. س. ج) ، والمؤسسة العلمية الروسية (منحه #19-15-00241 إلى ASC) ، ومعهد كارنسكا (A.S.C.) ، وسترارغين كي ، ستيفتيلسين كوننغ غوستاف بي اس 80-årsfond (A.S.C.) ، ستيفتيلسين Frimurare بارنهوسيت و Sallskapet Barnavard (P.T.N.) ، المجلس الصيني للمنح الدراسية (B.Z.). تم تمويل المجهر البؤري من قبل كنوت ومؤسسه اليس فالينبرغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
