Summary
Denne metode beskriver brugen af den R26R-Confetti (Confetti) musemodel til at studere mineraliseret væv, der dækker alle trin fra avls strategien til billedet erhvervelse. Inkluderet er en generel protokol, der kan anvendes på alle bløde væv og en modificeret protokol, der kan anvendes til mineraliseret væv.
Abstract
Mærkning en individuel celle i kroppen til at overvåge, hvilke celletyper det kan give anledning til og spore sin migration gennem organismen eller bestemme dens levetid kan være en kraftfuld måde at afsløre mekanismer for vævs udvikling og vedligeholdelse. Et af de vigtigste værktøjer, der i øjeblikket er til rådighed til at overvåge celler in vivo er Confetti musemodel. Confetti-modellen kan bruges til at genetisk mærke individuelle celler i levende mus med forskellige fluorescerende proteiner i en celletype specifik måde og overvåge deres skæbne, samt skæbnen for deres afkom over tid, i en proces, der kaldes klonal genetisk sporing eller klonal Lineage tracing. Denne model blev genereret for næsten et årti siden og har bidraget til en bedre forståelse af mange biologiske processer, især i forbindelse med stamcelle biologi, udvikling og fornyelse af voksne væv. Men at bevare det fluorescerende signal, indtil billed opsamling og samtidig opsamling af forskellige fluorescerende signaler er teknisk udfordrende, især for mineraliseret væv. Denne publikation beskriver en trinvis protokol til brug af Confetti-modellen til at analysere vækst pladens brusk, der kan anvendes på alle mineraliserede eller ikke-mineraliserede væv.
Introduction
Forbedrede metoder til at overvåge celle adfærd er ønskeligt at øge den eksperimentelle effektivitet, når du bruger dyremodeller. En af de mest informative tilgange til at overvåge celle adfærd in vivo er klonal Lineage Tracing med multi farve reporter muse stammer1, herunder den udbredte R26R-Confetti (Confetti) mus2. Ved genetisk mærkning enkelte celler med fluorescerende proteiner og efter disse celler over tid, forskere på mange områder har brugt Confetti musen til at afsløre indsigt i en lang række forskellige biologiske systemer.
Confetti Mouse er et loxP-baseret reporter-system, hvor CRE-afhængig DNA-rekombination forårsager et permanent udtryk af et af flere mulige fluorescerende proteiner i en stokastisk måde2. R26R-Confetti-allelen omfatter den allestedsnærværende udtrykte CAGG-promotor, som ligger umiddelbart opstrøms for en loxP-flankeret neoR-kassette2, hvis polyadenylerings sekvens afslutter transkriptionen3, efterfulgt af Brainbow 2,1 konstruere4. Derfor, CRE-medieret rekombination samtidig exciserer neoR-kassetten og fører til produktion af visse fluorescerende proteiner afhængigt af hvilke dele af brainbow 2,1 konstruere er skåret. Denne funktion gør Confetti musen ekstremt tilpasningsdygtig, fordi den kan bruges til at målrette enhver cellulær population i en mus, hvor en specifik CRE stamme er til rådighed. Passage af en vævs specifik CRE stamme med R26R-Confetti stammen giver specificiteten af mærkning. Dog bør CRE stammen også være inducerbar (f. eks CreERT eller CreERT2, som kræver Tamoxifen binding for at give dem mulighed for at komme ind i kernen og inducere DNA rekombination5), så mærkningen kan opnås på bestemte tidspunkter. Således, en cellulær population kan mærkes ved at injicere den resulterende CreERT-positive/Confetti-positive afkom med Tamoxifen på det ønskede tidspunkt og spores til en vis alder, når væv af interesse kan indsamles til analyse. Efter vævs behandling kan de fluorescently mærkede celler direkte visualiseres ved Konfokal mikroskopi, således at afkom af hver oprindeligt mærkede celle kan adskilles fra afkom genereret af enhver anden mærket celle baseret på deres specifikke fluorescerende således at der kan foretages en vurdering af clonalitet (dvs. klonal genetisk sporing).
På grund af fleksibiliteten i Confetti modellen, er det blevet anvendt til at studere udvikling og vedligeholdelse af mange forskellige væv i sundhed og sygdom2,6,7,8,9, 10,11. En almindelig måde at bruge modellen på er at mærke en bestemt population af celler og bestemme, hvilket væv de (og/eller deres afkom) har bidraget til. En sådan konstatering ved hjælp af denne fremgangsmåde var, at den voksne tand består af celler med en gliaceller oprindelse6. En anden anvendelse af modellen er at studere stamcelle homøostase. For eksempel afslørede Confetti-modellen, at stamcelle nicher i de intestinale Krypter gradvist bliver monoklonale, fordi nogle stamcelle kloner er dominerende under konkurrencen mellem stamceller2. Modellen kan også bruges til at vurdere celle spredning, hvilket er særligt nyttigt til at studere langsomt dividere celler. For eksempel blev klonal dannelse i artikulær brusk12 vurderet, og de kortsigtede virkninger af en pindsvin antagonist på vækstpladen chondrocytter i fem-ugers gamle mus blev undersøgt13.
På trods af den relative enkelhed af Confetti-modellen kan det fluorescerende signal være teknisk udfordrende at bevare indtil Billedsamlingen, især når man analyserer mineraliseret væv. Her beskriver protokollen en optimeret model til at bruge Confetti-musen med den postnatale knogle (op til 6 måneders alderen), hvilket gør det muligt at visualisere fluorescerende proteiner direkte ved hjælp af konfokale mikroskopi uden behov for immunodetektion. Denne forenklede protokol kan anvendes på ikke-mineraliserede væv. Desuden er der en beskrivelse af, hvordan prøverne opbevares for at bevare det fluorescerende signal i en længere periode på mindst 3 år. En skitse til protokollen er præsenteret i figur 1.
Protocol
Alt muse arbejde blev godkendt af det etiske udvalg for dyreforsøg (Stockholms nordlige udvalg/Norra Djurförsöksetiska Nämd) og udført i overensstemmelse med det svenske dyre agenturs bestemmelser og retningslinjer for dyreforsøg.
1. mus avl
- For at generere stammen, krydse R26R-Confetti musen med CRE linje af interesse. WEAN hvalpena på 21 dage af alder.
Bemærk: mus kan anvendes til avl fra ca. 8 ugers alderen eller i henhold til de lokale retningslinjer. Genotypebestemmelse (ikke beskrevet her) kan udføres fra biopsier indsamlet ved fravænning. Alderen ved fravænning kan justeres pr. lokale retningslinjer.
2. Confetti mærkning
Bemærk: denne mærknings strategi er passende for Tamoxifen inducerbare CRE stammer.
- Forbered en opløsning på op til 2,5 mg/mL Tamoxifen i majsolie i en glas flaske. Opløs ved opvarmning til 37 °c i en ovn i op til 60 min, omrøring hver 5 min ved hjælp af en vortex indtil pulveret er opløst.
Bemærk: for øgede doser af Tamoxifen kan opløsninger op til 20 mg/mL tilberedes ved hjælp af denne metode. - Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder, beskyttet mod lys.
- Inducerer rekombination ved at administrere 50 μL af 2,5 mg/mL Tamoxifen opløst i majsolie intraperitonealt på den første postnatale dag (P1).
Bemærk: i princippet kan Tamoxifen administreres i alle aldre, så tidligt som F1 generation. Dosis af Tamoxifen bør varieres baseret på CRE udtryk, mus alder, og eksperimentel applikation. Yderligere oplysninger findes i diskussionsafsnittet. CRE negative mus behandlet på samme måde kan bruges som en negativ kontrol for Confetti fluorescerende signaler.
Forsigtig: Sørg for, at dyrehandlere advares om brugen af Tamoxifen, og sørg for, at burmaterialer bortskaffes i henhold til lokale miljø-og sikkerhedsretningslinjer.
3. vævs indsamling
- Euthanize-mus på postnatale dag 27 (P27) ved gradvist at fylde den plads, der indeholder musene, med kuldioxid op til mindst 80% vol. og vedligeholde denne koncentration i 3 min. Udfør livmoderhals dislokation. Hold mus på is under dissektion af de andre dyr.
- Dissekere væv af interesse. Skitseret nedenfor er en protokol til indsamling af proksimale tibiale og distale femorale vækst plader og artikulær brusk i knæet, egnet til postnatale mus op til en alder af 6 måneder.
- Fjern huden omkring bagbenene så langt som foden, ved hjælp af skarp saks og tandede pincet.
- Groft trim musklen og fedtvæv fra benene med skarp saks.
Bemærk: Rengør ikke knoglerne perfekt, fordi de omgivende væv giver nogle strukturelle støtte, når skæring, men sørg for, at al hud er fjernet. - Ved hjælp af en skalpel skæres gennem det bløde væv, hvor toppen af benet møder kroppen, indtil femoral hovedet er synligt, så skær ledbåndene i hofteleddet for at fjerne benet.
Bemærk: Alternativt, hvis det ikke er muligt at finde femoral hovedet, skæres gennem femur tæt på hoften med stærk saks. - Dissekere foden fra resten af benet ved hjælp af en skalpel eller skarp saks.
4. vævs fiksering og-behandling
Bemærk: baseret på vævet af interesse, Følg en af de to protokoller beskrevet nedenfor (4,1 for blødt væv eller 4,2 for mineraliseret mus væv over en alder af ca 45 dage, som beskrevet nedenfor). For begge metoder opbevares de dissekerede prøver i 3,7% formaldehyd/fosfatbuffer saltopløsning (PBS) på is, mens de resterende dyr dissekteres.
- For blødt væv og mineraliseret skinnebenog og femora op til ca. P45 år, fastgør vævet i forkølet 3,7% formaldehyd/PBS i 6 timer, der rulles forsigtigt på en rotator ved 4 °c. Brug et volumen, der er mindst 10x større end vævet. Fortsæt direkte til trin 4,3.
- For mineraliseret væv, herunder skinnebenog og femora over en alder af ca. P45, kræves et afkalknings trin.
- Forbered 1 L af 10% EDTA/dH2O opløsning med ph justeret til 8,05 ved hjælp af natriumhydroxid. Dernæst fortyndes formaldehyd til 3,7% ved hjælp af denne opløsning. Den arbejdende koncentration af EDTA vil være 9%.
- Fastgør vævet ved at anbringe i forkølet 3,7% formaldehyd/PBS natten over, forsigtigt rullende på en rotator ved 4 °C.
- Væv i forkølet 3,7% formaldehyd/9% EDTA/dH2O opløsning (pH 8,05), og drej forsigtigt ved 4 °c i et volumen, der er mindst 10x større end vævet. Gentag dette trin ved at placere knoglerne i frisk, forkølet 3,7% formaldehyd/9% EDTA/dH2O for 3x over den næste 48 h.
Bemærk: denne korte afkalkning er nok til at give mulighed for skæring af femur og skinneben af op til 6 måneder gamle mus. For mere tæt mineraliseret væv kan yderligere afkalkning være nødvendig for at forbedre histologi.
- Væv overføres til forkølet 30% saccharose/dH2O. Sørg for at fylde beholderen til randen, og Roter forsigtigt natten over ved 4 °c. Brug et volumen, der er mindst 10x større end vævet. Vævet vil ofte flyde, når først placeres i denne løsning og synke til bunden af flasken om morgenen.
- For at fjerne rest saccharoseopløsningen vaskes vævet kortvarigt ved at fjerne det fra saccharoseopløsningen med tang og dække prøven fuldstændigt med ca. 5 ml optimal skære temperatur forbindelse (OCT) i flere sekunder.
- Fyld en propeled cryomold med OCT og Placer vævet i bunden. Arbejd hurtigt for at undgå, at prøverne sidder ved stuetemperatur i for lang tid.
Bemærk: det er vigtigt at placere prøven i en bekvem retning for skære trinnet. For at øge chancerne for skæring gennem hele vækstpladen søjler eftersporing med Col2CreERT: Confetti, Placer den mediale side vender ned ved hjælp af femoral hovedet som en guide, og Placer prøven så fladt til bunden af formen som muligt. - Integrer prøven ved at placere formen på tøris og vente på, at OLT helt størkner. Placer cryomolds så fladt som muligt for at undgå bevægelse/glidende væv i formen. Når de er færdige, opbevares prøverne ved-20 °C, hvis de ikke anvendes med det samme.
Bemærk: brug inden for 12 uger, fordi med alderen bliver blokkene sværere at afsnit.
5. skæring
Bemærk: Udfør kryosectioning ved hjælp af en kryostat med engangsklinger, der egner sig til hårdt væv. Enhver standard kryostat er egnet.
- Fjern blokken fra formen og fastgør den til borepatronen ved at anvende Oct mellem toppen af blokken og Chuck og afkøling i kryostat ved-20 °c i mindst 5 minutter, således at OLT er helt solidificeret.
- Forkøl både prøveholderen og klingeholderen til-20 °C, og Placer derefter prøven/patronen i borepatron holderen og klingen i klingeholderen for at ækvibrere i flere minutter.
Bemærk: de specificerede temperaturer kan varieres med flere grader afhængigt af kryostat og væv af interesse. - Brug kryostat til at trimme blokken og skære vævs sektioner af en passende tykkelse for at muliggøre visualisering af klonerne i vævet af interesse.
- For postnatal vækst plade analyse, Forbered sektioner på 30 − 160 μm og saml dem på slides. Nogle kryostat-modeller kan kun tillade indsamling af tykke sektioner ved hjælp af trim-indstillingen.
- Luft tør gliderne ved stuetemperatur, indtil de er helt tørre.
Bemærk: varigheden af dette trin kan variere baseret på vævs egenskaber og sektions tykkelse. Temperaturen i rummet er også sandsynligt, at påvirke hastigheden af dette trin. - Opbevar diasene ved-20 °C i op til 36 måneder, eller Fortsæt med at gå til trin 6,2, hvis det straks behandles.
6. klargøring og montering af slide
- Fjern sliden fra fryseren og Bring op til stuetemperatur vandret i en slide holder. Lad kondenseringen fordampe.
- Fjern OLT ved at bruge en Pasteur-pipette til forsigtigt at påføre PBS ved stuetemperatur på sliden. Jo tykkere sektionen er, jo længere tid er der brug for. For 160 μm tykke sektioner skal du udføre to skylinger: Inkuber én gang i 15 minutter og fjern væsken, og Påfør derefter frisk PBS i 5 minutter og fjern væsken.
Bemærk: dette trin er at fjerne OLT og kan varieres baseret på vævs egenskaber og snittykkelse, efter behov. Temperaturen i rummet vil sandsynligvis påvirke hastigheden af dette trin. - Monter diasene i en opløsning på 75% 2, 2-thiodiethanol/dH2O ved stuetemperatur med 60 mm lange dæksedler.
Bemærk: lysbilleder kan tilberedes umiddelbart før billeddannelse, men det fluorescerende signal er stabilt i 1 − 2 uger, hvis det holdes ude af lyset i et befuret kammer ved 4 °C.
7. billeddannelse ved Konfokal mikroskopi
- Konfigurer mikroskopet.
- Tænd for mikroskopet, og Åbn softwaren. Klik på knappen Start system .
- Vælg kanalerne ved først at klikke på Smart setup under fanen anskaffelse og derefter vælge de tre kanaler, som svarer til rødt fluorescerende protein (RFP), gult fluorescerende protein (yfp) og cyan fluorescerende protein (FFP) under Farvestof overskrift. Klik på bedste signal , og Anvend derefter for at vælge laserne.
Bemærk: indholdet af fanen anskaffelse vises i supplerende fil 1a. Hvis de påkrævede kanaler ikke er til stede, skal du tilføje dem ved hjælp af knappen '+' under farve overskriften. De nødvendige oplysninger om laser, excitation bølgelængder, og rækken af indspillede emission bølgelængder er vist for de tre Confetti fluorescerende proteiner i supplerende fil 1b-D. - Vælg 20x objektiv-objektivet under overskriften målsætning under fanen anskaffelses tilstand .
- Find vækstpladen eller andet væv af interesse.
- Hvis du vil angive en tydelig visning, skal du først vælge RFP-kanalen ved at klikke på dens navn under fanen kanaler . Dette medfører, at der vises oplysninger om RFP-kanalen under fanen lyskurve . Klik på afkrydsningsfeltet ved siden af T-PMT.
Bemærk: T-PMT-kanalen viser ikke-reflekteret laserlys, som bruges til at visualisere de ikke-fluorescerende dele af vævet. - Placer diaset i slide holderen og Placer vækstpladen eller andet væv af interesse direkte mellem lysbanen og objektivlinsen.
- For at forenkle lokaliseringen af vævet skal du fravælge YFP-og CFP-kanalerne ved hjælp af afkrydsningsfelterne under spor overskriften på fanen kanaler .
- Vælg T-PMT-kanalen ved at klikke på dens navn i overskriften spor . Klik på Live under fanen anskaffelse , og Forøg Gain (Master) for T-PMT-kanalen for at visualisere vævs afsnittet på skærmen, som vises i gråskala.
- Flyt placeringen af diaset ved hjælp af joysticket for at finde interesseområdet, og Fokusér derefter med den relevante mikroskop knap.
- Klik på stop under fanen anskaffelse for at slå laser eksponeringen fra.
- Hvis du vil angive en tydelig visning, skal du først vælge RFP-kanalen ved at klikke på dens navn under fanen kanaler . Dette medfører, at der vises oplysninger om RFP-kanalen under fanen lyskurve . Klik på afkrydsningsfeltet ved siden af T-PMT.
- Definer billedbehandlings parametrene.
- Brug afkrydsningsfelterne på fanen kanaler til at vælge en af kanalerne, og klik på Live under fanen anskaffelse for at få vist billedet af kanalen på skærmen. Derefter, ved hjælp af venstre-klik-knappen på musen, justere slide-søjler for at indstille det udsendte fluorescerende signal, der indsamles, laser effekt (glidende bjælke under lasere overskriften), Gain (Master) og digital offset i Fanen kanaler for at visualisere de konfetti-mærkede celler på skærmen. Vejledende værdier for alle disse parametre er angivet i den supplerende fil 1b-D for RFP, yfp og CFP. Gennemfør dette trin for hver kanal, en efter en.
Bemærk: for at sikre, at det visualiserede signal ikke er autofluorescens, kan en sektion fra et CRE-negativt dyr bruges som en negativ kontrol under dette trin. Da T-PMT er blevet kombineret med RFP-laseren (trin 7.2.1), vil justeringen af laser effekten for RFP påvirke T-PMT-signalet. - Juster størrelsen på Pinhullet for at øge fluorescens detektering, hvis det er nødvendigt.
Bemærk: jo højere pinhole størrelse, jo mere fluorescerende signal detekteres i Z-retningen. En retningslinje for dette er den resulterende luftig enhed (AU), som automatisk angives under pinhole indikatoren, hvor 1 AU er optimal til billedbehandlings kvalitet. At øge AU for meget vil forringe senere analyse, fordi det bliver vanskeligere at skelne individuelle celler i Z-retningen). - Kontroller opsætningen for at sikre, at de optagede signaler ikke overlapper hinanden.
- Klik på afkrydsningsfelterne på fanen kanaler for at vælge alle tre kanaler, og tryk på knappen Fastgør under fanen anskaffelse .
- I det resulterende billede skal du rulle mellem de viste kanaler ved at klikke på de blå Fremhævede bokse over hver angivet kanal under fanen dimensioner . Kontroller manuelt overlapningen mellem kanalerne på skærmen. Hvis signalerne overlapper hinanden (f. eks. Hvis hver rød celle også er gul), skal du vende tilbage til begyndelsen af trin 7,3 og gentage, justere parametrene for de overlappende kanaler, indtil de kan skelnes fra hinanden. Sørg for, at der for hver etiket (f. eks. RFP, YFP eller CFP) kan visualiseres mindst én klon, der kun indeholder en af etiketterne.
- Brug afkrydsningsfelterne på fanen kanaler til at vælge en af kanalerne, og klik på Live under fanen anskaffelse for at få vist billedet af kanalen på skærmen. Derefter, ved hjælp af venstre-klik-knappen på musen, justere slide-søjler for at indstille det udsendte fluorescerende signal, der indsamles, laser effekt (glidende bjælke under lasere overskriften), Gain (Master) og digital offset i Fanen kanaler for at visualisere de konfetti-mærkede celler på skærmen. Vejledende værdier for alle disse parametre er angivet i den supplerende fil 1b-D for RFP, yfp og CFP. Gennemfør dette trin for hver kanal, en efter en.
- Erhverve billede.
- Vælg fanen anskaffelses tilstand for at angive billedkvalitet ved hjælp af billed størrelse, hastighedog gennemsnitstalværdier .
Bemærk: de typiske indstillinger for disse eksperimenter er angivet i supplerende fil 1a. Hvis du reducerer Zoom under overskriften for scanningsområdet på fanen anskaffelse , kan du øge synsfeltet uden at ændre den tid, der kræves til billed anskaffelse. - Klik på afkrydsningsfeltet Z-stak under overskriften dimensions anskaffelse under fanen anskaffelse . Åbn fanen z-stack for at indstille intervallet mellem billeder i Z-retningen til 2,5 μm.
- Hvis du vil angive de korrekte placeringer, skal du kun vælge RFP/T-PMT under fanen kanaler og klikke på Live for at visualisere de røde kloner med en synlig kontur af vævet. Angiv det første og sidste udsnit ved at klikke på Angiv først og Indstil sidst på det tilsvarende udsnit, og Juster fokus ved hjælp af mikroskop knappen.
- Klik på fanen felt scanning under fanen anskaffelse , og Angiv det samlede antal felter i de vandrette og lodrette retninger i de respektive bokse.
- For billedoptagelse skal du vælge alle de ønskede kanaler på fanen kanaler og derefter klikke på knappen Fastgør for at indsamle et enkelt billede eller knappen Start eksperiment for at indsamle en Z-stak/flise scanning.
- Vælg fanen anskaffelses tilstand for at angive billedkvalitet ved hjælp af billed størrelse, hastighedog gennemsnitstalværdier .
- Når billedet er erhvervet, skal du klikke på filer og derefter Gem som og gemme billedet i en filtype, der bevarer så mange oplysninger om mikroskop indstillingerne som muligt, for at tillade senere gennemsyn og genbrug.
- Udfør yderligere analyse ved hjælp af billedanalyse software.
Representative Results
At mærke chondrocytter i epifyseal brusk og visualisere deres klonal ekspansion med alderen ved hjælp af Tamoxifen administration på P1, Col2CreERT: Confetti mus blev mærket, og deres baglemmer blev indsamlet på P27. Den centrale del blev bestemt ved at visualisere korsbånd (figur 2a), og kloner i den proksimale tibiale vækst plade blev visualiseret (figur 2b). Disse data viser, at individuelle celler, der var Kol2-positive på P1 og blev mærket med Confetti fluorescerende proteiner, når Tamoxifen blev administreret, undergik klonal ekspansion, og derefter forblev i vækstpladen indtil P27. De indledende ændringer i klonal ekspansion fra et lignende udviklingsmæssige tidspunkt kan ses i figur 1 i en nylig publikation13.
For at give et eksempel på det fluorescerende signal efter langtidsopbevaring (trin 5,5) blev det indsamlede afsnit opbevaret umiddelbart efter (Se figur 2A, B) i mere end 3 år, før det blev forberedt og afbildet (figur 2c, video 1) .
For at påvise nogle almindeligt forekommende problemer med protokollen, vises et afsnit, der er brudt under kryosectioning-trinnet, i figur 3a. Regionen i afsnittet (mellem vækstpladen og artikulær brusk) udvidet i figur 3b viser, at denne dosis af Tamoxifen fører til et så højt niveau af rekombination i dette område, at det ville udelukke klonal analyse.
Figur 1: eksperimentel oversigt. Rutediagram, som opsummerer de vigtigste stadier i metoden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Confetti-billeder fra en Col2CreERT: Confetti-mus. A) prøver af Col2CreERT: Confetti-mus blev behandlet uden afkalkning eller det langvarige opbevarings trin. Den centrale del blev placeret ved hjælp af korsfæstet ligament som en markør. Dette billede blev visualiseret ved hjælp af en flise scanning efter detektering af RFP med T-PMT (Scale bar = 300 μm). B) klonale søjler vises i den proksimale skinneben på vækstpladen, som er synlig i (A), efter 3D-genopbygning. C) et tilstødende dias, der er vist i litraa) ogB), og som opbevares i langtidsopbevaring i mere end 3 år, blev forarbejdet til billeddannelse og 3D-genopbygning. RFP, YFP og CFP er vist i (B) og (C) (skala stænger = 50 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: udfordringer ved brug af metoden. A) de hvide stiplede linjer skitserer en opdeling i afsnittet gennem vækstpladen på Col2CreERT: Confetti-mus (Scale bar = 50 μm). Området i den hvide boks vises i (B) (skala stang = 25 μm). RFP, YFP og CFP vises i begge paneler, og den ikke-reflekterede laserlys-kanal (T-PMT) vises også i (A) for at visualisere vævet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: tredimensionel rekonstruktion af en vækst plade fra Col2CreERT: Confetti Mouse. En slide fremstillet af en Col2CreERT: Confetti mus blev holdt i langtidsopbevaring efter skæring i mere end 3 år, og derefter behandlet til Imaging. Tredimensionel rekonstruktion blev udført automatisk med billedanalyse software og eksporteret som en video. Venligst klik her for at downloade denne video.
Supplerende fil 1: typisk opsætning af det konfokale mikroskop. A) de vigtigste Kontroller, der findes under fanen anskaffelse . (B−D) laser parametrene, excitation bølgelængde, og rækken af indspillede emissions bølgelængder er vist for tre Confetti fluorescerende proteiner. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Confetti-modellen blev anvendt i udstrakt grad til at studere mineraliseret brusk vævet12,13,14 og til at beskrive den optimerede protokol. Confetti-mus2 med en kopi eller to eksemplarer af R26R-Confetti-allelen kan bruges til avl og eksperimenter. Rekombination i mus med en allel af Brainbow 2,1 konstruere vil give fire potentielle etiketter: rødt fluorescerende protein (RFP, cytoplasmic), gult fluorescerende protein (YFP, cytoplasmic), cyan fluorescerende protein (FFP, membran-lokaliseret), og grøn fluorescerende protein (GFP, Nucleus-lokaliseret), hvorimod rekombination i homozygot Confetti-mus (dvs. med to eksemplarer af Brainbow 2,1-konstruktionen) giver 10 mulige farve udgange (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + FFP, RFP + GFP, yfp + YFP, YFP + FFP, YFP + GFP, DEN FÆLLES FISKERIPOLITIK + FFP, DEN FÆLLES FISKERIPOLITIK + GFP, GFP + GFP). Men fordi DNA excision og inversion hændelser forekommer i en stokastisk måde, rekombination til at producere GFP forekommer i kun en lille brøkdel af celler, som tidligere rapporteret2, og tilsyneladende adskiller sig fra celle-type eller CRE linje anvendes2, 12,13. I betragtning af den lave forekomst af rekombinationhændelser, der fører til GFP-udtrykket, er seks farve udgange de mest almindelige i homozygot Confetti-mus.
En vigtig overvejelse ved planlægning af eksperimenter med Confetti musen er at finde en passende CRE stamme. Først, da Confetti allel har flere loxp sites, en rekombination begivenhed udelukker ikke en anden4. Det betyder, at hvis en celle er mærket og opdeler til at producere en klon af en farve, en anden rekombination begivenhed i en af sine datter celler ville generere en anden farve, og dermed maskere den sande klonede ekspansion. Således er ikke-inducerbare CRE-stammer, hvor enzymet altid er aktivt, hvis den tilsvarende promotor er aktiv, ikke tilrådeligt. For det andet, i nogle stammer udtrykket af CRE rekombinase ofte kommer på bekostning af en endogene protein, og dermed skabe en fænotype af sin egen (f. eks, for Prg4-GFPCreERT2 Knock-in musestamme, hvor mus havn to CRE alleler15), så en enkelt kopi af CRE allel er ønskelig. I alle de beskrevne eksperimenter, en enkelt kopi af Col2CreERT16 blev båret af enten den mandlige eller den kvindelige forælder til at generere Col2CreERT: Confetti mus, som beskrevet13. Dernæst er specificiteten af CRE-linjen til celle typen af interesse en vigtig overvejelse. For eksempel, Col2CreERT er chondrocyte-specifikke, men etiketter flere forskellige populationer af chondrocytter i tidlig postnatal brusk17. Endelig kan aktiviteten af forskellige CRE-stammer ændre sig betydeligt med dyrenes alder, da den endogene aktivitet af arrangøren udnyttet til CRE-ekspressions ændringer, selv i celler af samme type (f. eks. Prg4-GFPCreERT2, hvilket kan kræve en stigende antal Tamoxifen doser til at mærke overfladiske zone celler som mus alder15).
Antallet af mærkede celler vil blive afspejlet af mængden af Tamoxifen givet, så det er ikke altid ønskeligt at give den maksimale dosis, fordi det kan være svært at skelne kloner fra hinanden. Fordi CRE udtryk vil variere i henhold til reguleringen af forskellige initiativtagere samt med alderen, Tamoxifen dosis skal justeres for at optimere mærkning. Det er vigtigt at bemærke, at cellerne ikke umiddelbart fluorescerende ved udløsning rekombination, fordi tiden er nødvendig for rekombination at forekomme og de resulterende fluorescerende proteiner til at akkumulere tilstrækkeligt til billeddannelse. En bred vifte af timer (mellem 24 − 72 h) er nødvendig, som synes at være påvirket af CRE linje, celle-type, og dyre alder. Da Tamoxifen kan være biologisk aktiv længe efter administration18 er det altid tilrådeligt at grundigt kontrollere rekombinationseffektivitet i hver model.
Under den konfokale mikroskopi trin, excitation af Confetti fluorescerende proteiner kræver penetration af vævet ved laserlys. Fordi forskellige væv har forskellige egenskaber, kan laserlys ikke trænge ind 160 μm tykke sektioner af alle væv. Dog kan sådanne tykke sektioner anvendes til vækst plade brusk, som anvendes i figur 2, figur 3. Bemærk, at hvert mikroskop er forskelligt, og det er usandsynligt, at de beskrevne indstillinger (supplerende fil 1) vil fungere perfekt uden mindre justeringer. En af de største udfordringer er at skelne mellem de forskellige fluorescerende proteiner for at sikre, at der ikke er kontaminering fra den ene kanal til den anden. F. eks. overlapper signalet i YFP-kanalen, som er forårsaget af fluorescensen fra GFP, mellem YFP-og RFP-kanalerne. Kanalerne i YFP og den fælles fiskeripolitik skal også kontrolleres nøje. Dette kan gøres på flere måder. For det første, emissions intervallet af fluorescerende lys bølgelængder, der er registreret for hvert fluorescerende protein kan indsnævret. For det andet, justering af laser kraft i kombination med den digitale gevinst kan optimere signalet. I denne undersøgelse var disse trin tilstrækkelige, men de er afhængige af et stærkt fluorescerende signal. Det betyder, at ineffektiv vævs behandling i teorien kan reducere aktiviteten af de fluorescerende proteiner, eller en svag laserlyskilde kan forringe kanal separationen.
En af fordelene ved Confetti-musen er, at den kan kombineres med et stort antal genetisk mutante stammer, der er tilgængelige, så virkningen af specifikke gener på klonal dynamik kan undervises10,11,12 ,13,14,19,20, omend med nogle begrænsninger. For eksempel kan rekombination af Confetti alleler og Genets interesse ikke adskilles ved brug af CRE loxP-baserede mutanter kombineret med klonal Lineage tracing. Ikke desto mindre, sådanne sammenfaldende rekombination begivenheder kan være effektiv10,14,20. For eksempel blev denne mulighed brugt til at udforske det øgede celle nummer i hvile zonen for mus efter postnatal chondrocyte-specifik ablation af TSC1 i vækstpladen21 og afslørede det klonale forhold mellem disse celler over tid 13. Derudover kan den vævsspecifikke klon analyse ved hjælp af Confetti-mus anvendes med ikke-CRE loxp-baseret mutant mus11, og det er også muligt at kombinere disse tilgange med farmakologiske8,9 ,13 og/eller kirurgiske modeller8 for at visualisere klonale responser på andre funktionelle forstyrrelser. Der opstår yderligere muligheder ved kombination af Confetti-mærkede sektioner med immunodetektion af endogene proteiner ved hjælp af immunofluorescens. En sådan analyse gør det muligt at identificere sporede celler og deres samlokalisering med en kendt markør. Med fikserings metoden beskrevet heri er det muligt at gennemføre immunofluorescens og stadig visualisere fluorescensen fra konfetti fluorescerende proteiner12,13. I de nævnte papirer var det imidlertid ikke nødvendigt at hente antigen. Barske antigen genfinding metoder, såsom kogning i citratbuffer, fører til et fuldstændigt tab af Confetti fluorescens. Selv om konfetti fluorescerende proteiner kan detekteres ved hjælp af antistoffer22, kan der forekomme tab af klonal identitet.
Sammenfattende, ved hjælp af Confetti model til at mærke celler in vivo er et informativt værktøj til at analysere skæbnen for disse celler over tid. Den beskrevne metode giver en hurtig og effektiv måde at direkte visualisere fluorescerende protein udtryk i mineraliseret væv.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Evgeny Ivashkin for metodologisk rådgivning. Dette arbejde blev støttet finansielt af det svenske Forskningsråd (A. S. C), det russiske videnskabelige Institut (Grant #19-15-00241 til ASC), Karolinska instituttet (A.S.C.), StratRegen KI og stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), stiftelsen Frimurare barnhuset og sallskapet Barnavard (P.T.N.), kinesisk stipendie Råd (B.Z.). Confokal mikroskop blev finansieret af Knut og Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
