Summary
Этот метод описывает использование модели мыши R26R-Confetti (Confetti) для изучения минерализованных тканей, охватывающих все этапы от стратегии размножения до приобретения изображения. Включен общий протокол, который может быть применен ко всем мягким тканям и измененный протокол, который может быть применен к минерализованным тканям.
Abstract
Маркировка отдельных клеток в организме, чтобы контролировать, какие типы клеток это может привести к и отслеживать его миграцию через организм или определить его долговечность может быть мощным способом выявления механизмов развития и поддержания тканей. Одним из наиболее важных инструментов, доступных в настоящее время для мониторинга клеток in vivo, является модель мыши Confetti. Модель Confetti может быть использована для генетически маркировки отдельных клеток у живых мышей с различными флуоресцентными белками в клеточном типе-специфического образом и контролировать их судьбу, а также судьбу их потомства с течением времени, в процессе, называемом клональным генетическим отслеживанием или клональная линия отслеживания. Эта модель была создана почти десять лет назад и способствовала более глубокому пониманию многих биологических процессов, в частности связанных с биологией стволовых клеток, развитием и обновлением тканей взрослых. Однако сохранение флуоресцентного сигнала до сбора изображений и одновременного захвата различных флуоресцентных сигналов является технически сложной задачей, особенно для минерализованной ткани. Эта публикация описывает пошаговой протокол для использования модели Confetti для анализа роста пластины хряща, которые могут быть применены к любой минерализованной или неминерализованной ткани.
Introduction
Улучшенные методы мониторинга поведения клеток желательно повысить экспериментальную эффективность при использовании моделей животных. Один из самых информативных подходов для мониторинга поведения клеток in vivo является клональная линия трассировки с многоцветной репортёр мыши штаммов1, в том числе широко используется R26R-Confetti (Confetti) мышь2. По генетически маркировки отдельных клеток с флуоресцентными белками и после этих клеток с течением времени, исследователи во многих областях использовали мышь Confetti, чтобы выявить понимание множества различных биологических систем.
Мышь Confetti является loxP-системы репортера, в котором Cre зависимых рекомбинации ДНК вызывает постоянное выражение одного из нескольких возможных флуоресцентных белков в стохастической образом2. R26R-Confetti аллель включает в себя повсеместно выраженный промоутер CAGG, который лежит сразу вверх по течению loxP-фланговые NeoR-кассета2, чья последовательность полиаденилации прекращает транскрипции3, а затем Brainbow 2.1 построить4. Таким образом, Cre-опосредованноерекомбинации одновременно акцизы Neo R-кассета и приводит к производству определенных флуоресцентных белков в зависимости от того, какие части Brainbow 2.1 конструкции вырезаны. Эта функция делает мышь Confetti чрезвычайно адаптируемой, потому что она может быть использована для целевой любой клеточной популяции в мыши, для которой имеется определенный штамм Cre. Пересечение ткани конкретных Cre штамм с R26R-Confetti штамм обеспечивает специфику маркировки. Тем не менее, штамм Cre также должен быть индуцированным (например, CreERT или CreERT2, которые требуют связывания тамоксифена, чтобы позволить им войти в ядро и вызвать рекомбинацию ДНК5),так что маркировка может быть достигнута в указанные моменты времени. Таким образом, клеточная популяция может быть помечена путем введения резвенного CreERT-позитивного/Confetti-положительного потомства с тамоксифеном в нужную точку времени и отследить до определенного возраста, когда ткани интереса могут быть собраны для анализа. После обработки тканей, флуоресцентно помеченные клетки могут быть непосредственно визуализированы конфокальной микроскопией, так что потомство каждой первоначально маркированной клетки могут быть отделены от потомства, генерируемого любой другой помеченной клеткой на основе их специфических флуоресцентных этикетки, тем самым позволяющие оценивать клональность (т.е. клональную генетическую трассировку).
Благодаря гибкости модели Confetti, он был применен для изучения развития и поддержания многих различных тканей в области здоровья и болезней2,6,7,8,9, 10,11. Один из распространенных способов использования модели заключается в маркировке определенной популяции клеток и определении того, какие ткани они (и/или их потомство) внесли свой вклад. Одним из таких выводов с помощью этого подхода было то, что взрослый зуб состоит из клеток с глиальным происхождением6. Еще одно применение модели является изучение гомеостаза стволовых клеток. Например, модель Confetti показала, что ниши стволовых клеток в кишечных склепов постепенно становятся моноклональными, потому что некоторые клоны стволовых клеток доминируют во время конкуренции между стволовыми клетками2. Модель также может быть использована для оценки пролиферации клеток, что особенно полезно для изучения медленно деления клеток. Например, было оценено клональное образование в суставном хряще12, а кратковременные эффекты антагониста ежа на рост плиты хондроцитов у пятинедельных мышей изучали13.
Несмотря на относительную простоту модели Confetti, флуоресцентный сигнал может быть технически сложным для сохранения до сбора изображений, особенно при анализе минерализованных тканей. Здесь протокол описывает оптимизированную модель для использования мыши Confetti с послеродовой костью (до 6 месяцев), что позволяет флуоресцентным белкам быть непосредственно визуализированы конфокальной микроскопией без необходимости иммунообнаружения. Этот упрощенный протокол может быть применен к неминерализованным тканям. Кроме того, включено описание того, как хранить образцы для сохранения флуоресцентного сигнала в течение длительного периода не менее 3 лет. Набросок протокола представлен на рисунке 1.
Protocol
Вся работа с мышью была одобрена Комитетом по этике по экспериментам на животных (Стокгольмский Северный комитет/Норра Джурфюрсёксетиска Немд) и проведена в соответствии с положениями и руководящими принципами Шведского агентства по животным.
1. Разведение мышей
- Чтобы создать штамм, пересеките мышь R26R-Confetti с линией интереса Cre. Отвазь щенков в 21 день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши могут быть использованы для разведения примерно с 8 недель, или в соответствии с местными руководящими принципами. Генотипирование (не описанное здесь) может быть выполнено из биопсий, собранных при отлуже. Возраст отлятения может быть скорректирован в зависимости от местных руководящих принципов.
2. Маркировка конфетти
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта стратегия маркировки подходит для тамоксифена индуцированных штаммов Cre.
- Приготовьте раствор до 2,5 мг/мл тамоксифена в кукурузном масле в стеклянной бутылке. Растворите при нагревании до 37 градусов в духовке до 60 мин, агитируя каждые 5 минут с помощью вихря, пока порошок не растворится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения дозы тамоксифена, решения до 20 мг/мл могут быть подготовлены с помощью этого метода. - Хранить при 4 градусах по Цельсию до 3 месяцев, защищенных от света.
- Побудить рекомбинацию путем введения 50 л 2,5 мг/мл тамоксифена, растворенного в кукурузном масле внутрипереперитоневого масла в первый послеродовой день (P1).
ПРИМЕЧАНИЕ: В принципе, тамоксифен может быть введен в любом возрасте, уже в поколении F1. Доза тамоксифена должна быть разнообразной в зависимости от экспрессии Cre, возраста мыши и экспериментального применения. Дополнительную информацию можно найти в разделе обсуждения. Cre отрицательных мышей, обработанных таким же образом, могут быть использованы в качестве отрицательного контроля для confetti флуоресцентных сигналов.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что обработчики животных предупреждены об использовании тамоксифена и убедитесь, что материалы клетки удаляются в соответствии с местными экологическими принципами и правилами безопасности.
3. Коллекция тканей
- Эвтаназия мышей в послеродовой день 27 (P27) путем постепенного заполнения пространства, содержащего мышей с углекислым газом до по крайней мере 80% по объему и поддержания этой концентрации в течение 3 мин. Выполните вывих шейки матки. Держите мышей на льду во время вскрытия других животных.
- Вскрыть ткани интереса. Ниже приведен протокол для сбора проксимальных tibial и дистальных пластин роста бедренной и суставной хряща колена, подходит для послеродовых мышей в возрасте до 6 месяцев.
- Удалите кожу вокруг задних конечностей, насколько ноги, используя острые ножницы и зубчатые щипцы.
- Грубо обрезают мышечную и жировую ткань с ног острыми ножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не очищайте кости идеально, потому что окружающие ткани обеспечивают некоторую структурную поддержку при сечении, но убедитесь, что вся кожа удаляется. - С помощью скальпеля, прорезать мягкую ткань, где в верхней части ноги встречает тело, пока бедренная голова видна, а затем сократить связки в тазобедренном суставе, чтобы удалить ногу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, если это не возможно, чтобы найти бедренную голову, прорезать бедренную кетворку близко к бедру с сильными ножницами. - Вскрыть ногу от остальной части ноги с помощью скальпеля или острые ножницы.
4. Фиксация и обработка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на ткани, представляющие интерес, следуйте одному из двух протоколов, описанных ниже (4.1 для мягких тканей или 4.2 для минерализованных тканей мыши в возрасте около 45 дней, как описано ниже). Для обоих методов храните расчлененные образцы в 3,7% раствора формальдегида/фосфата буферного солей (PBS) на льду при вскрытии оставшихся животных.
- Для мягких тканей и минерализованных голени и феморы до возраста около P45, исправить ткани в предварительно охлажденных 3,7% формальдегида / PBS в течение 6 ч, прокатки мягко на ротатор при 4 градусах Цельсия. Используйте объем, по крайней мере, в 10 раз больше, чем у ткани. Продолжить непосредственно шаг 4.3.
- Для минерализованных тканей, включая голени и фемору в возрасте старше 45 лет, требуется этап декальцинации.
- Приготовьте 1 л 10% раствора EDTA/dH2O с рН, скорректированным до 8,05 с использованием гидроксида натрия. Далее разбавить формальдегид до 3,7% с помощью этого раствора. Рабочая концентрация ЭДТА составит 9%.
- Исправить ткани, поместив в предварительно охлажденных 3,7% формальдегида / PBS ночь, осторожно прокатки на ротатор при 4 градусах Цельсия.
- Поместите ткань в предварительно охлажденный 3,7% формальдегида/ 9% EDTA/dH2O раствор (pH 8.05), и осторожно поверните при 4 градусах Цельсия в объеме по крайней мере 10x больше, чем у ткани. Повторите этот шаг, поместив кости в свежие, предварительно охлажденные 3,7% формальдегида / 9% EDTA/dH2O для 3x в течение следующих 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта короткая декальцинация достаточно, чтобы позволить для секции бедренной кости и голени кости до 6 месяцев назад мышей. Для более плотно минерализованных тканей может потребоваться дальнейшая декальцинация для улучшения гистологии.
- Перенесите ткань в предварительно охлажденные 30% сахарозы/дГ2O. Убедитесь в том, чтобы заполнить контейнер до краев, и осторожно повернуть на ночь при 4 градусах Цельсия. Используйте объем, по крайней мере, в 10 раз больше, чем у ткани. Ткань часто плавать, когда впервые помещается в этот раствор и опуститься на дно бутылки к утру.
- Чтобы удалить остаточный раствор сахарозы, кратко вымойте ткань, удалив ее из раствора сахарозы с помощью щипцы и полностью покрывая образец примерно 5 мл оптимального соединения температуры резки (OCT) в течение нескольких секунд.
- Заполните предварительно отметированный криомольд OCT и поположите ткань внизу. Работайте быстро, чтобы избежать образцов, сидящих при комнатной температуре слишком долго.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поместить образец в удобную ориентацию для шага секции. Чтобы увеличить шансы на секция через весь рост пластины столбцов после отслеживания с Col2CreERT: Confetti, место медиальной стороны вниз с помощью бедренной головы в качестве руководства, и положение образца, как плоские в нижней части формы, как это возможно. - Вложите образец, поместив форму на сухой лед и ожидая OCT полностью затвердеть. Поместите криомольды как можно более плоским, чтобы избежать движения / скольжения ткани в форму. После завершения, хранить образцы на -20 градусов по Цельсию, если они не используются сразу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте в течение 12 недель, потому что с возрастом блоки становятся более трудными для раздела.
5. Секция
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните криосекцию с помощью криостата с одноразовыми лезвиями, подходящими для твердых тканей. Любой стандартный криостат подходит.
- Удалите блок из формы и закрепите его на патрон, применяя OCT между верхней части блока и патрон и охлаждения в криостате при -20 градусов по Цельсию, по крайней мере 5 минут, так что OCT полностью затвердела.
- Precool как выборки держателя и держателя лезвия до -20 градусов по Цельсию, а затем поместить образец / патрон в держатель патрона и лезвие в держатель лезвия, чтобы уравновесить в течение нескольких минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные температуры могут варьироваться на несколько градусов в зависимости от криостата и ткани интереса. - Используйте криостат, чтобы обрезать блок и вырезать участки ткани подходящей толщины, чтобы обеспечить визуализацию клонов в ткани, представляющие интерес.
- Для анализа плиты послеродового роста подготовьте участки по 30–160 мкм и соберите их на слайдах. Некоторые модели криостата могут разрешать сбор толстых секций только с помощью комплектации.
- Воздух сушит горки при комнатной температуре, пока они полностью не высохнут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность этого шага может варьироваться в зависимости от свойств ткани и толщины сечения. Температура в помещении также может повлиять на скорость этого шага. - Храните слайды при -20 градусов по Цельсию в течение 36 месяцев, или при немедленной обработке, приступаем к шагу 6.2.
6. Подготовка и монтаж слайдов
- Снимите слайд из морозильной камеры и доведите до комнатной температуры горизонтально в держателе слайда. Разрешить любой конденсации испаряться.
- Удалите OCT с помощью пипетки Pasteur, чтобы аккуратно нанести PBS при комнатной температуре на горку. Чем толще секция, тем больше времени требуется. Для 160 мкм толщиной разделов, выполнить два полоски: инкубировать один раз в течение 15 минут и удалить жидкость, а затем применить свежие PBS в течение 5 минут и удалить жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в удалении OCT и может быть разнообразным в зависимости от свойств ткани и толщины сечения, по мере необходимости. Температура в помещении, вероятно, повлияет на скорость этого шага. - Смонтировать горки в растворе 75% 2,2-тиодианола/дГ2О при комнатной температуре с 60 мм длинной крышкой скользит.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть подготовлены непосредственно перед визуализацией, но люминесцентный сигнал стабилен в течение 1–2 недель, если его не проникать в свет в увлажненной камере при 4 градусах Цельсия.
7. Изображение с помощью конфокальной микроскопии
- Навязай микроскоп.
- Включите микроскоп и откройте программное обеспечение. Нажмите кнопку «Стартовая система».
- Выберите каналы, сначала нажав Smart Setup под вкладкой Приобретение, а затем выберите три канала, соответствующие красному флуоресцентному белку (RFP), желтому флуоресцентному белку (YFP) и цианианному флуоресцентному белку (CFP) под Краситель заголовок. Нажмите Лучший сигнал, а затем применить, чтобы выбрать лазеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Содержимое вкладки Приобретение отображается в дополнительном файле 1A. Если требуемых каналов нет, добавьте их с помощью кнопки 'q' под заголовком dye. Необходимая информация о лазерных, возбуждая длинах волн, и диапазон записанных длин волн выбросов показано для трех confetti флуоресцентных белков в дополнительном файле 1B-D. - Выберите объектив 20x объективной под заголовком «Объектив» во вкладке «Режим приобретения».
- Найдите пластину роста или другие ткани, представляющие интерес.
- Чтобы предоставить четкое представление, сначала выберите канал RFP, нажав его имя во вкладке Каналов. Это приводит к тому, что детали канала RFP отображаются во вкладке "Путь света". Нажмите на тик-бокс рядом с T-PMT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Канал T-PMT показывает неотраженный лазерный свет, который используется для визуализации нефлуоресцентных частей ткани. - Поместите слайд в держатель слайда и поместите пластину роста или другие ткани, представляющие интерес непосредственно между световой траекторией и объективным объективом.
- Для упрощения локализации ткани, отображайте каналы YFP и CFP с помощью тик-боксов под заголовком "Каналы".
- Выберите канал T-PMT, нажав на его имя в заголовке Треков. Нажмите Live в вкладке Приобретение и увеличить прибыль (Мастер) для канала T-PMT для того, чтобы визуализировать раздел ткани на экране, который отображается в сером масштабе.
- Переместите положение слайда с помощью джойстика, чтобы найти интересуемый регион, а затем сосредоточьтесь с помощью соответствующей ручки микроскопа.
- Нажмите «Остановить» во вкладке «Приобретение», чтобы выключить лазерное воздействие.
- Чтобы предоставить четкое представление, сначала выберите канал RFP, нажав его имя во вкладке Каналов. Это приводит к тому, что детали канала RFP отображаются во вкладке "Путь света". Нажмите на тик-бокс рядом с T-PMT.
- Определите параметры изображения.
- Используйте тик-боксы во вкладке Каналов, чтобы выбрать один из каналов и нажмите Live в вкладке Приобретение для отображения изображения этого канала на экране. Затем, используя кнопку слева нажатия на мышь, отрегулируйте слайд-бары, чтобы установить диапазон испускаемого флуоресцентного сигнала, который собирается, лазерная мощность (скользящая панель под заголовком Лазеры), Gain (Master) и Digital Offset в Вкладка каналов для визуализации клеток с маркировкой Confetti на экране. Ориентировочные значения для всех этих параметров приведены в дополнительном файле 1B-D для RFP, YFP и CFP. Выполните этот шаг для каждого канала, один за 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения визуализированный сигнал не аутофлуоресценции, раздел от Cre отрицательного животного может быть использован в качестве отрицательного контроля во время этого шага. Поскольку T-PMT был объединен с лазером RFP (шаг 7.2.1), регулирующая лазерная мощность RFP будет влиять на сигнал T-PMT. - Отрегулируйте размер Pinhole, чтобы при необходимости увеличить обнаружение флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чем выше размер пинхола, тем больше флуоресцентного сигнала обнаруживается в направлении. Ориентиром для этого является резунт-подразделение Airy Unit (AU), которое автоматически указывается под индикатором Pinhole, где 1 а.е. является оптимальным для качества изображения. Увеличение АС слишком много будет ухудшать более поздний анализ, потому что становится все труднее различать отдельные клетки в направлении. - Проверьте настройку, чтобы убедиться, что записанные сигналы не перекрываются.
- Нажмите на тик-боксы во вкладке Каналов, чтобы выбрать все три канала и нажать кнопку Snap во вкладке Приобретение.
- В резу изображения, прокрутите между отображаемыми каналами, нажав на сине-выделенные коробки над каждым перечисленным каналом в вкладке Размеры. Если сигналы перекрываются (например, если каждая красная ячейка также желтая), вернитесь к началу шага 7.3 и повторите, регулируя параметры для перекрывающихся каналов, пока их не отличить друг от друга. Убедитесь, что для каждой метки (например, RFP, YFP или CFP) можно визуализировать по крайней мере один клон, содержащий только одну из меток.
- Используйте тик-боксы во вкладке Каналов, чтобы выбрать один из каналов и нажмите Live в вкладке Приобретение для отображения изображения этого канала на экране. Затем, используя кнопку слева нажатия на мышь, отрегулируйте слайд-бары, чтобы установить диапазон испускаемого флуоресцентного сигнала, который собирается, лазерная мощность (скользящая панель под заголовком Лазеры), Gain (Master) и Digital Offset в Вкладка каналов для визуализации клеток с маркировкой Confetti на экране. Ориентировочные значения для всех этих параметров приведены в дополнительном файле 1B-D для RFP, YFP и CFP. Выполните этот шаг для каждого канала, один за 1.
- Приобретите изображение.
- Выберите вкладку «Режим приобретения», чтобы указать качество изображения, используя значения размера frame, speedи Averaging Number.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные настройки для этих экспериментов указаны в дополнительном файле 1A. Уменьшение масштабирования под заголовком «Область сканирования» в вкладке «Приобретение» может увеличить поле зрения без изменения времени, необходимого для приобретения изображения. - Во вкладке «Приобретение» под заголовком «Мерное приобретение» щелкните тик-бокс «Стек». Откройте вкладку «Стек», чтобы установить интервал между изображениями в направлении к 2,5 мкм.
- Чтобы установить правильные местоположения, выберите только RFP/T-PMT во вкладке Каналов и нажмите Live, чтобы визуализировать красные клоны с видимым контуром ткани. Установите первый и последний срез, нажав set First и установите последний на соответствующем срезе, регулируя фокус с помощью ручки микроскопа.
- Нажмите на вкладку Tile Scan в вкладке Приобретение и введите общее количество плиток в горизонтальных и вертикальных направлениях в соответствующих коробках.
- Для захвата изображения выберите все нужные каналы во вкладке Каналов, а затем нажмите кнопку Snap, чтобы собрать одно изображение, или кнопку Start Experiment, чтобы собрать стек/сканирование плитки.
- Выберите вкладку «Режим приобретения», чтобы указать качество изображения, используя значения размера frame, speedи Averaging Number.
- После того, как изображение было приобретено, нажмите Файл, затем сохраните как и сохраните изображение в типе файла, который сохраняет как можно больше информации о настройках микроскопа, чтобы позволить последующему просмотру и повторному использованию.
- Выполняйте дальнейший анализ с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
Representative Results
Для обозначения хондроцитов в эпификациальном хрящеи и визуализации их клонального расширения с возрастом с помощью тамоксифена администрации на P1, Col2CreERT:Confetti мышей были помечены, и их задние конечности были собраны на P27. Центральный раздел был определен путем визуализации крестообразной связки(Рисунок 2A) и клоны в проксимальной пластины роста косых были визуализированы(рисунок 2B). Эти данные показывают, что отдельные клетки, которые были Col2-положительный на P1 и стал помечены Confetti флуоресцентных белков, когда тамоксифен был введен, прошли клональной расширения, а затем остался в рост пластины до P27. Первоначальные изменения в клональном расширении от аналогичной точки времени развития можно увидеть на рисунке 1 недавней публикации13.
Чтобы привести пример флуоресцентного сигнала после длительного хранения (шаг 5.5), собранный раздел хранился сразу после (см. Рисунок 2A,B) в течение более 3 лет, прежде чем он был подготовлен и изображен(Рисунок 2C, Видео 1) .
Чтобы продемонстрировать некоторые общие проблемы с протоколом, раздел, сломанный во время криосекционного шага, показан на рисунке 3A. Область секции (между пластиной роста и суставным хрящом), расширенная на рисунке 3B, показывает, что эта доза тамоксифена приводит к такому высокому уровню рекомбинации в этой области, что это исключило бы анализ клона.
Рисунок 1: Экспериментальный обзор. Диаграмма потока, обобщающая ключевые этапы метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Конфетти изображения из Col2CreERT: Confetti мыши. (A) Образцы Col2CreERT:Confetti мышей были обработаны без декальцинации или долгосрочного шага хранения. Центральная секция была расположена с использованием крестообразной связки в качестве маркера. Это изображение было визуализировано с помощью сканирования плитки после обнаружения RFP с помощью T-PMT (шкала бар 300 мкм). (B) Клональные колонны показаны в проксимальной тибии пластины роста видны в (A), после 3D реконструкции. (C) Смежный слайд, который показан в (A) и (B) провел в долгосрочном хранении в течение более 3 лет был обработан для визуализации и 3D-реконструкции. RFP, YFP и CFP отображаются в (B) и (C) (Шкала баров 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Проблемы при использовании метода. (A) Белые линии пунктирной наметить раскол в разделе через рост пластины Col2CreERT: Confetti мышей (шкала бар 50 мкм). Область в белом поле отображается в (B) (Шкала бар 25 мкм). RFP, YFP и CFP показаны в обеих панелях, а неотраженный лазерный свет (T-PMT) также показан в(A) для визуализации ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Трехмерная реконструкция пластины роста от Col2CreERT: Мышь Confetti. Слайд, приготовленный из col2CreERT: Confetti мыши был проведен в долгосрочном хранении после секции в течение более 3 лет, а затем обрабатываются для визуализации. Трехмерная реконструкция проводилась автоматически с помощью программного обеспечения для анализа изображений и экспортировалась в виде видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Дополнительный файл 1: Типичная настройка конфокального микроскопа. ()Основные элементы управления, присутствующие в вкладке Приобретение. (BиD) Лазерные параметры, волнообразное возбуждение длины волны, и диапазон записанных длин волн выбросов показаны для трех люминесцентных белков Confetti. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Модель Confetti широко использовалась для изучения минерализованных тканей хряща12,13,14 и для описания оптимизированного протокола. Конфетти мышей2 с одной копией или двумя копиями аллеля R26R-Confetti могут быть использованы для разведения и экспериментов. Рекомбинация у мышей с одним аллелем конструкции Brainbow 2.1 даст четыре потенциальных метки: красный флуоресцентный белок (RFP, цитоплазматический), желтый флуоресцентный белок (YFP, цитоплазмический), циановый флуоресцентный белок (CFP, мембранно-локализованный) и зеленый зеленый флуоресцентный белок (GFP, ядро-локализованный), в то время как рекомбинация у гомозиготных мышей Confetti (т.е. содержащие две копии конструкции Brainbow 2.1) даст 10 возможных цветовых выходов (RFP-RFP, RFP-YFP, RFP-CFP, RFP-FFP, RFP-FFP, RFP-FFP, RFP-YFP GFP, CFP-CFP, CFP-GFP, GFP-GFP). Однако, поскольку иссечение ДНК и инверсии события происходят в стохастической образом, рекомбинации для производства GFP происходит только в небольшой части клеток, как сообщалось ранее2, и, казалось бы, отличается по типу клеток или Cre линии используется2, 12,13. Таким образом, учитывая низкий уровень рекомбинации событий, ведущих к выражению GFP, шесть цветовых выходов являются наиболее распространенными в гомозиготных мышей Confetti.
Важным соображением при планировании экспериментов с мышью Confetti является поиск подходящего штамма Cre. Во-первых, так как аллель Confetti имеет несколько сайтов loxP, одно событие рекомбинации не исключает второго4. Это означает, что если ячейка помечена и делится, чтобы произвести клон одного цвета, второе событие рекомбинации в одной из дочерних ячеек будет генерировать другой цвет, тем самым маскируя истинное клональное расширение. Таким образом, невызывающиеся штаммы Cre, где фермент всегда активен, если соответствующий промоутер активен, не рекомендуется. Во-вторых, в некоторых штаммов выражение Cre рекомбиназы часто приходит за счет эндогенного белка, тем самым создавая собственный фенотип (например, для Prg4-GFPCreERT2 стук-в мыши штамм, в котором мыши гавани два Cre аллелей15), так что одна копия Аллеля Cre желательно. Во всех описанных экспериментах, одна копия Col2CreERT16 была проведена либо мужчины или женщины родителей для создания Col2CreERT: Confetti мышей, как описано13. Далее, специфичность Cre линии к типу ячейки интерес является важным фактором. Например, Col2CreERT является хондроцитов конкретных, но этикетки несколько различных популяций хондроцитов в начале послеродового хряща17. Наконец, активность различных штаммов Cre может значительно измениться с возрастом животного, так как эндогенная активность промоутера используется для Cre изменения выражения, даже в клетках того же типа (например, Prg4-GFPCreERT2, которые могут потребовать увеличения количество дозах тамоксифена для обозначения поверхностных клеток зоны, как мыши в возрасте15).
Количество помеченных клеток будет отражаться количеством данного тамоксифена, поэтому не всегда желательно давать максимальную дозу, так как отличить клонов друг от друга может быть сложно. Потому что Cre выражение будет меняться в соответствии с регулированием различных промоутеров, а также с возрастом, тамоксифен дозировка должна быть скорректирована для оптимизации маркировки. Важно отметить, что клетки не сразу флуоресцентные при запуске рекомбинации, потому что время требуется для рекомбинации происходит и в результате флуоресцентные белки накапливаться достаточно для визуализации. Требуется широкий диапазон часов (между 24–72 ч), что, по-видимому, зависит от линии Кре, типа клеток и возраста животных. Так как тамоксифен может быть биологически активным долго после введения18 всегда целесообразно тщательно проверить эффективность рекомбинации в каждой модели.
Во время шага конфокальной микроскопии возбуждение флуоресцентных белков Confetti требует проникновения в ткани лазерным светом. Поскольку различные ткани имеют различные свойства, лазерный свет не может проникать 160 мкм толщиной разделов всех тканей. Тем не менее, такие толстые секции могут быть использованы для роста пластины хряща, как это используется на рисунке 2, Рисунок 3. Обратите внимание, что каждый микроскоп отличается, и маловероятно, что описанные настройки(Дополнительный файл 1) будет работать идеально без незначительных корректировок. Одна из основных проблем заключается в том, чтобы различать различные флуоресцентные белки, чтобы убедиться, что нет загрязнения от одного канала к другому. Например, сигнал в канале YFP, вызванный флуоресценцией, поступающей от GFP, перекрывается между каналами YFP и RFP. Каналы YFP и CFP также должны быть тщательно проверены. Это можно сделать несколькими способами. Во-первых, диапазон выбросов люминесцентных длин световых волн, которые регистрируются для каждого флуоресцентного белка, может быть сужен. Во-вторых, регулировка мощности лазера в сочетании с цифровым усилением может оптимизировать сигнал. В этом исследовании этих шагов было достаточно, но они полагаются на сильный флуоресцентный сигнал. Это означает, что в теории, неэффективная обработка тканей может снизить активность флуоресцентных белков, или слабый лазерный источник света может ухудшить разделение канала.
Одним из преимуществ мыши Confetti является то, что она может быть объединена с большим количеством генетически мутантных штаммов, которые доступны так, что влияние конкретных генов на клональную динамику можно изучить10,11,12 ,13,14,19,20, хотя и с некоторыми ограничениями. Например, рекомбинация аллелей Confetti и гена интереса не могут быть разделены при использовании Cre loxP основе мутантов в сочетании с клональной линии отслеживания. Тем не менее, такие совпадающие события рекомбинации могут бытьэффективными 10,14,20. Например, эта возможность была использована для изучения увеличения числа клеток в зоне покоя мышей после послеродовой хондроцитов конкретных абляции TSC1 в рост пластины21 и показал клональные отношения между этими клетками с течением времени 13. Кроме того, ткани конкретных клональный анализ с использованием Confetti мышей могут быть использованы с не-Cre loxP основе мутантов мышей11, и это также можно объединить эти подходы с фармакологическим8,9 ,13 и/или хирургические модели8 для визуализации клональных реакций на другие функциональные возмущения. Дополнительные возможности возникают при объединении конфетти помеченных разделов с иммунодиагностикой эндогенных белков иммунофлуоресценцией. Такой анализ позволяет выявить прослеженный клетки и их колокализацию с помощью известного маркера. С помощью метода фиксации, описанного в настоящем, можно проводить иммунофлуоресценцию и при этом визуализировать флуоресценцию из флуоресцентных белков Confetti12,13. Однако, в упомянутых документах, поиск антигена не требуется. Суровые методы извлечения антигенов, такие как кипячение в цитратном буфере, приводят к полной потере флуоресценции Confetti. Хотя Confetti флуоресцентные белки могут быть обнаружены с помощью антител22, потеря клональной идентичности может произойти.
Таким образом, использование модели Confetti для обозначения клеток in vivo является информативным инструментом для анализа судьбы этих клеток с течением времени. Описанный метод обеспечивает быстрый и эффективный способ непосредственнов визуализации флуоресцентного белка экспрессии в минерализованных тканях.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Благодарим доктора Евгения Ивашкина за методологическую консультацию. Финансовую поддержку этой работе оказали Шведский научно-исследовательский совет (A.S.C.), Российский научный фонд (грант #19-15-00241 аСК), Каролинский институт (A.S.C.), StratRegen KI и Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-sfond (A.S.C.), Stiftelsen Фримурар Барнхусет и Сальскакет Барнавард (P.T.N.), Китайский совет стипендий (B.). Конфокальный микроскоп финансировался Фондом Кнута и Элис Валленберг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
