Summary
Her presenterer vi en modifisert screeningmetode som kan brukes mye til raskt å screene RNA-deaktiveringssuppressorer i plantepatogener.
Abstract
RNA-deaktivering er en evolusjonært bevart, sekvensspesifikk genreguleringsmekanisme i eukaryoter. Flere plantepatogener har utviklet proteiner med evnen til å hemme vertsanlegget RNA-deaktiveringsveien. I motsetning til viruseffektorproteiner har bare flere utskillede effektorproteiner vist evnen til å undertrykke RNA-deaktivering i bakteriell, oomycete og sopppatogener, og de molekylære funksjonene til de fleste effektorer forblir i stor grad ukjente. Her beskriver vi i detalj en litt modifisert versjon av koinfiltrasjonsanalysen som kan tjene som en generell metode for å observere RNA-deaktivering og for karakterisering av effektorproteiner utskilt av plantepatogener. De viktigste trinnene i tilnærmingen er å velge de sunne og fullt utviklede bladene, justere bakteriekulturen til riktig optisk tetthet (OD) ved 600 nm, og observere grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens på optimal tid på infiltrert forlater for å unngå å utelate effektorer med svak undertrykkelse aktivitet. Denne forbedrede protokollen vil bidra til rask, nøyaktig og omfattende screening av RNA-deaktiveringssuppressorer og tjene som et utmerket utgangspunkt for å undersøke de molekylære funksjonene til disse proteinene.
Introduction
I løpet av de siste to tiårene har akselerasjon i genomsekvensering av mikroorganismer som forårsaker plantesykdommer ført til et stadig økende kunnskapsgap mellom sekvensinformasjon og de biologiske funksjonene til kodede proteiner1. Blant molekylene som avsløres av sekvenseringsprosjekter er effektormolekyler som undertrykker medfødt immunitet og letter vertskolonisering; Disse faktorene utskilles av destruktive plantepatogener, inkludert bakterier, nematoder og filamentous mikrober. For å svare på disse truslene har vertsplanter utviklet nye reseptorer som gjenkjenner disse effektene, noe som muliggjør restaurering av immunresponsen. Derfor er effektorer gjenstand for ulike selektive trykk, noe som fører til diversifisering av effekteller repertoarer blant patogene linjer2. I de senere årene har antatte effektorer fra plantepatogener vist seg å forstyrre plantemedfødt immunitet ved å hindre vertscellulære prosesser til fordel for mikrobene på en rekke måter, inkludert dysregulering av signalveier, transkripsjon, intracellulær transport, cytoskjelettstabilitet, vesicle trafficking og RNA silencing3,4,5. Men de aller fleste patogene effektorer, spesielt de fra filamentous patogener, har vært gåtefulle.
RNA-deaktivering er et homologimediert geninaktiveringsmaskiner som bevares blant eukaryoter. Prosessen utløses av lang dobbelt-strandet RNA (dsRNA) og retter seg mot homologen en-strandet RNA (ssRNA) på en sekvens-spesifikk måte, og det manipulerer et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert antiviral forsvar6. For å overgå medfødte immunresponser fra verten, har noen virus utviklet seg til å oppveie RNA-deaktivering, inkludert evnen til å replikere inne i intracellulære rom eller flykte fra det omorganiserte signalet. Likevel er den mest generelle strategien der virus beskytter sine genomer mot RNA-deaktiveringsavhengig tap av genfunksjon å kode spesifikke proteiner som undertrykker RNA-deaktivering7,8. Flere mekanistisk forskjellige tilnærminger har blitt etablert for å screene og karakterisere viralsuppressorer av RNA-deaktivering (VSRs), inkludert samtidig infiltrasjon av Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgene planter som uttrykker putative suppressors, pode og cellekultur9,10,11,12,13.
Hver av disse analyser har fordeler og ulemper, og identifiserer VSRs på sin egen distinkte måte. En av de vanligste tilnærmingene er basert på samtidig infiltrasjon av individuelle A. tmuefaciens kulturer som skjuler det potensielle virale proteinet og et reportergen (typisk grønt fluorescerende protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c-planter som utgjør gfp under kontroll av blomkålmosaikkviruset 35S-arrangøren. I fravær av en aktiv viral deaktivering suppressor, er GFP identifisert som eksogene av vertscellene og er dempet innen 3 dager etter infiltrasjon (dpi). Derimot, hvis virusproteinet har undertrykkelsesaktivitet, forblir uttrykksnivået til GFP stabilt utover 3−9 dpi9. Denne koinfiltrasjonsanalysen er enkel og rask; Det er imidlertid verken svært stabilt eller følsomt. Likevel har analysen identifisert mange VSRs med ulike proteinsekvenser og strukturer i mange RNA-virus7,8.
Nylig har flere effektorproteiner som kan hemme den cellulære RNA-deaktiveringsaktiviteten blitt karakterisert fra bakteriell, oomycete og soppplantepatogener14,15,16. Disse funnene innebærer at RNA-deaktivering av undertrykkelse er en vanlig strategi for å legge til rette for infeksjon som brukes av patogener i de fleste riker. I teorien kan mange, om ikke alle, av effektorene kode RNA-deaktiveringssuppressorer (RSSs); Hittil har imidlertid bare noen få blitt identifisert, hovedsakelig på grunn av mangel på den pålitelige og generelle screeningstrategien. Videre har suppressors av RNA deaktivering ikke blitt undersøkt i de aller fleste plante patogener17.
I denne rapporten presenterer vi en optimalisert og generell protokoll for å identifisere plantepatogeneeffektorer som kan undertrykke lokale og systemiske RNA-deaktivering ved hjelp av agro-infiltrasjonsanalysen. Målet med denne studien var å understreke de viktigste aspektene ved protokollen og beskrive trinnene i detalj, og dermed gi en screeninganalyse som passer for nesten alle effektorer av plantepatogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle trinnene i prosedyren skal utføres ved romtemperatur (RT).
FORSIKTIG: Sett alle medier som inneholder patogene mikrober, samt planter og plantevev som brukes i analysen, i de riktige avfallsbeholderne og autoklaven før kassering.
1. Utarbeidelse av plasmidkonstruksjoner som inneholder antatte effektorer
- Velg antatte utskillede effektorer som er svært uttrykt under infeksjon, som bestemt av RNA-sekvensering (RNA-Seq), og videre av kvantitativ sanntidPCR (qRT-PCR) teknikk.
- Bestem signalpeptidspaltingsstedet for hver effektor ved hjelp av et programvareverktøy som SignalP18.
- Design primere og utføre PCR for å forsterke genet koding effekten av interesse ved hjelp av høy kvalitet DNA polymerase. Utfør agarose gel elektroforese for å sjekke PCR-produktet, deretter klone amplicon i Gateway entry vector pQBV3 ved hjelp av ligation-fri kloning kit (Table of Materials), og deretter inn i destinasjonsuttrykket vektor pEG100 ved hjelp av LR rekombinasjonsreaksjon19.
- Forvandle 3-5 μL LR-reaksjonsblandingen til 100 μL kompetente E. coli-celler (f.eks. TOP10, DH5α), spre de transformerte bakteriecellene på Luria-Bertani (LB) agarmedium supplert med 50 μg/ml kanamycin, og inkuber ved 37 °C i 16–20 h.
MERK: Positive transformanter kan identifiseres ved koloni EN PCR20 og videre analyseres av plasmid miniprep og sekvensering. - Introduser 50-100 ng rekombinant plasmider som bærer effekteller protein i 100 μL kjemisk kompetente A. tumefaciens celler (f.eks GV3101 eller C58C1), bland forsiktig, og frys deretter i flytende nitrogen i 1 min. Tin cellene i et 37 ° C vannbad i 5 min.
- Tilsett 500 μL LB kjøttkraft og inkubator ved 30 °C i 4-6 timer med mild risting, og overfør og spre alle agrobakteriecellene på LB agar medium supplert med 50 μg/ml kanamycin og 50 μg/ml rifampicin ved 30 °C i 2 dager.
MERK: Positive kloner kan verifiseres av kolonien PCR. - Bruk en enkelt forvandlet koloni for agro-infiltrasjoneksperimenter med mindre annet er rettet.
MERK: I den nåværende forskningen inneholdt ingen av de testede effektorgenene for utviste troner; hvert av genene ble direkte forsterket fra genomisk DNA av en Phytophthora sojae isolat. En gateway planteuttrykksvektor uten kode anbefales, men ikke nødvendig.
2. Utarbeidelse av N. benthamiana 16c planter
- Forbered pottejordblandinger bestående av (etter volum) 50% torvmose, 30% perlite, og 20% vermiculite, og autoklav ved 120 °C i 20 min.
- Bløtlegg autoklamerte jordblandinger med plantegjødseloppløsning (1 g/L) og underpakke dem i mindre gryter (80 mm x 80 mm x 75 mm) lagret i en større skuff (540 mm x 285 mm x 60 mm).
- Så en eller to frø av N. benthamiana 16c på jordoverflaten av hver pott. Dekk brettet med en plastkuppel og la frøene spire.
- Plasser brettet under lys- og temperaturkontrollerte vekstkamre med en temperatur på 23-25 °C, 50–60 % relativ fuktighet og en lang dags fotoperiode (14 timer lys/10 timer mørk, med belysning ved 130–150 μE·m-2s-1).
- Ta av plastkuppelen etter frøene (3–4 dager) og la plantene vokse under de samme forholdene som brukes til spiringstrinnet.
- Tilsett en passende mengde vann, hold jordfuktig, men ikke soaking, hver 2−3 dager; legge gjødsel hver 10 dager for å fremme videre vekst. Vedlikehold N. benthamiana 16c planter under normale forhold til de er klare til bruk; på dette stadiet bør anlegget ha minst fem fullt utviklede sanne blader og ingen synlige aksillære eller blomsterknopper, og bladene skal ha et sunt grønt utseende).
- Bruk 3-4 uker gamle blader av N. benthamiana 16c for lokale RNA-dempende analyser, og unge N. benthamiana 16c planter (10-14 dager gammel) for systemiske RNA-dempende analyser.
MERK: Plantevekstforhold og anlegg varierer på tvers av laboratorier; velge sunne, velutviklede og fullt utvidede blader for infiltrasjon.
3. Utarbeidelse av Agrobacterium kultur for infiltrasjon
- Velg en positiv koloni fra LB-platen og inokuler cellene i glassrør som inneholder 5 ml LB medium supplert med 50 μg/ml kanamycin og 50 μg/ml rifampicin. Dyrke cellene ved 30 °C med risting ved 200 o/min i 24-48 timer.
- Overfør 100 μL kultur til 5 ml LB medium supplert med samme antibiotika, 10 mM 2-(N-morpholino) etanisulfonsyre (MES; pH 5.6) og 20 μM acetosyringone (AS). Dyrke bakterier ved 30 °C med risting ved 200 o/min i 16-20 timer.
- Sentrifugeceller ved 4000 x g i 10 min. Hell av supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml 10 mM MgCl2 buffer.
- Gjenta trinn 3.3 for å sikre fullstendig fjerning av antibiotika.
- Bestem tettheten av Agrobacterium-kulturen ved å måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD600). Juster til en OD600 på 1,5-2,0 med 10 mM MgCl2 buffer.
- Tilsett 10 mM MES (pH 5.6) og 150 μM AS til de endelige suspensjonskulturene og inkuber cellene ved RT i minst 3 timer uten risting.
MERK: Ikke la de endelige suspensjonskulturene stå over natten.
4. Co-infiltrasjon N. benthamiana blader
- Bland like volumer av en Agrobacterium kultur som inneholder 35S-GFP med en Agrobacterium kultur som inneholder 35S- agurk mosaikk virus suppressor 2b (CMV2b), putative effektor, eller tom vektor (EV).
- Infiltrere forsiktig og langsomt de blandede agrobacterium suspensjonene på abaxial sidene av N. benthamiana 16c blader ved hjelp av en 1 ml nåleløs sprøyte.
- Fjern gjenværende bakteriell suspensjon fra bladene med bløtvevsviskere og sirkel margene i de infiltrerte patchene med en traktpenn.
- La de infiltrerte plantene ligge i vekstkammeret under de samme vekstforholdene.
MERK: Av sikkerhets- og helsehensyn skal vernebriller og en maske brukes under infiltrasjon. For å forhindre krysskontaminering bør hanskene endres eller steriliseres med etanol mellom infiltrasjoner. Normalt er det nødvendig med minst 1 ml agrobacteriumsuspensjoner per blad for infiltrasjon. For systemisk deaktivering vil minst to blader være nødvendig for infiltrasjon.
5. GFP bildeanalyse
- Visuelt oppdage GFP fluorescens i nydyrkede blader av hele planter 2 uker etter infiltrasjon (for systemisk RNA-deaktivering) eller infiltrerte flekker av blader 3-4 dpi ved hjelp av en langbølgeultrafiolett (UV) lampe uten blader samling.
- Fotografi samlet planter og / eller frittliggende blader med et digitalt kamera utstyrt med både UV og gule filtre.
MERK: For analyser av lokal deaktiveringundertrykkelse undersøker du infiltrerte flekker av N. benthamiana 16c blader, mens for systemisk deaktivering suppresjonsaktivitet, undersøke nydyrkede blader. RNA-deaktivering suppresjonsaktivitet kan variere på tvers av individuelle effektorer. Derfor observere flekker eller blader over noen dager starter på 3 dpi. Bruk henholdsvis CMV2b og EV som positive og negative kontroller.
6. Nordblot analyse av GFP mRNA nivåer i infiltrerte blader
- Isolering av totalt RNA fra bladvev ved hjelp av RNA isolasjonreagens (Materialtabell)
- Samle bladvev fra infiltrerte N. benthamiana 16c patcher på 4-7 dpi, pulveriser i flytende nitrogen til et fint pulver, og overfør pulveret til et sterilt 2 ml rør.
- Tilsett RNA isolasjonreagen (1 ml/100 mg vev) umiddelbart til det samplede røret i en hette, rist kraftig for å homogenisere og inkubere ved RT i 5 min.
- Tilsett kloroform (200 μL/1 ml RNA isolasjonreagens) til hvert rør i en hette, rist kraftig i 15 s og inkuber ved RT i 5 min. Sentrifuge homogenatet ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt RNase-fritt rør og kast pelleten. Tilsett 0,7 volum isopropanol til supernatanten, inverter forsiktig flere ganger, og inkuber blandingen ved RT i 10 min.
- Utfell RNA-pelleten ved sentrifugering ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Kast supernatanten, vask pelleten med 70% etanol og lufttørk pelleten i en hette. Løs RNA i diethyl pyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann ved å inkubere i et 65 °C vannbad i 10–20 min.
- Nordlig blot analyse av GFP mRNA nivå i infiltrerte blader
- Forbered en 1,2% formaldehyd denatureing agarose gel i 1x MOPS kjører buffer.
- Bland RNA 1:1 med RNA lasting dye og denature ved inkubasjon ved 65 ° C i 10 min, umiddelbart chill de denatured prøvene på is i 1 min.
- Legg prøvene på gelen og elektroforeseved 100 V i 50 min til RNA er godt separert.
- Skyll gelen i 20x saltvannsnatriumsitrat (SSC) buffer for å fjerne formaldehyd og overføre gelen til nylonmembran ved kapillæroverføring i 20x SSC-buffer over natten. Bløtlegg membranen i 2x SSC og fest RNA til membranen ved å utsette den våte membranen til UV-krysskobling.
- Tilsett riktig mengde hybridiseringsbuffer (10 ml per 100 cm2 membran; Tabell over materialer) i et hybridiseringsrør og agiter ved 60 °C i en hybridiseringsovn.
- Sett membranen i hybridiseringsrøret og inkuber i 60 min ved 60 °C. Fortynn en 5'DIG-merket DNA-sonde (endelig konsentrasjon, 50 ng / ml) inn i hybridiseringsløsningen som inneholder prewarmed hybridiseringsbuffer.
- Kast prehybridiseringsbufferen og skift straks ut med prewarmed hybridiseringsløsning som inneholder den DIG-merkede sonden. Inkuber flekken med sonde ved 60 °C over natten, med mild agitasjon.
- Etter hybridisering, vask membranen to ganger i buffere med økende stringency ved 60 °C i 20 min hver. Tørk forsiktig av membranen for å fjerne ekstra vaskebuffer og tilsett reagenser som foreslått i chemiluminescent hybridiserings- og deteksjonssettet (Materialtabell).
- Oppdag hybridiserte signaler ved chemiluminscent reaksjon kombinert med bildesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovenfor beskriver vi trinnvis prosedyre for en forbedret screeninganalyse for å vurdere RSS-aktiviteten til P. sojae RxLR-effektorer. Til sammen tar eksperimentet 5-6 uker. Deretter kan RSSs identifisert av analysen karakteriseres ytterligere når det gjelder funksjon og molekylær mekanisme. Som et eksempel på vår tilnærming brukte vi P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor av RNA-deaktivering 1 (PSR1), som utskilles og leveres til vertsceller gjennom haustoria under infeksjon.
For å bekrefte at PSR1 har RSS-aktivitet og dermed er egnet for denne metoden, ble hver forvandlet agrobacterium stamme blandet med en belastning som huser 35S-GFP og ble infiltrert i blader av N. benthamiana 16c. EV og CMV2b ble brukt som henholdsvis negative og positive kontroller (figur 1). GFP-uttrykket nådde det høyeste nivået i blader infiltrert med alle blandinger ved 2-3 dpi. Grønn fluorescensintensitet forble sterk i patcher som ble infiltrert med 35S-GFP pluss CMV2b i løpet av en 6-9-dagers observasjonsperiode21. Samtidig infiltrasjon av GFP med PSR1 resulterte også i sterkere GFP-fluorescens i løpet av en 3,5-4,5 dagers periode med observasjoner, som vist ved forhøyet fluorescens i de infiltrerte flekkene. Fluorescensintensiteten i patcher infiltrert med 35S-GFP og EV svekket seg imidlertid med 3 dpi. Ved 4−5 dpi var GFP fluorescens knapt påviselig (figur 1).
Northern blot viste at GFP mRNA akkumulert høyere i bladene uttrykker 35S-GFP pluss 35S-CMV2b eller 35S-GFP pluss 35S-PSR1 enn i bladene uttrykker 35S-GFP pluss EV (Figur 2). Transkripsjonsuttrykk av PSR1 og CMV2b bidro dermed til stabiliseringen av GFP mRNA, noe som resulterte i forhøyet GFP-fluorescens.
Vi brukte også agro-infiltrasjonsanalysen til å evaluere spredningen av silencing-signalet i bladene av 2 uker gamle N. benthamiana 16c frøplanter. Til dette formål valgte vi vanligvis 3-4 større blader for hele bladene injeksjon. Ved 14 dpi viste mer enn 98% av EV åpenbart ingen GFP-signalering i systemiske blader, mens både PSR1 og CMV2b effektivt hemmet den systemiske spredningen av det dempende signalet ved å observere GFP-fluorescens i ca 80% av medinfiltrerte planter, og i de resterende 20% av infiltrerte planter med bare noen få røde årer dukket opp i nyoppståtte blader (Figur 3).
Figur 1: Phytophthora sojae RxLR-effektor PSR1 undertrykker lokal RNA-deaktivering i Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) 16c planter. Fullt utviklede blader av 3-4 uker gamle N. benthamiana 16c planter (venstre panel) ble co-infiltrert i patcher med Agrobacterium blandinger bærer 35S-GFP og konstruksjonene angitt over hvert bilde. GFP fluorescens av det infiltrerte området ble avbildet under naturlig lys (midtpanel) og langbølget UV-lys (høyre panel) ved 4 dpi. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. Røde piler representerer infiltrerte blader. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Akkumulering av GFP mRNA i infiltrerte N. benthamiana 16c blader. CK og EV representerer N. benthamiana 16c forlater alene og 16c forlater co-infiltrert med 35S-GFP pluss EV. Prøver fra EV og CMV2b ble brukt som henholdsvis negative og positive kontroller. I tillegg ble rRNA brukt som en lastekontroll. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: P. sojae RxLR-effektor PSR1 undertrykker systemisk RNA-deaktivering i N. benthamiana 16c planter. Tre eller fire blader av 2 uker gamle N. benthamiana 16c frøplanter (venstre panel) ble forbigående co-infiltrert av Agrobacterium husing 35S-GFP og enten EV eller vektor uttrykke PSR1 eller CMV2b fra 35S arrangør. GFP fluorescens av nydyrkede blader ble avbildet under naturlig lys (øvre panel) og langbølget UV-lys (nedre panel) ved 14 dpi. Dette eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. Røde piler indikerte infiltrerte blader. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-deaktivering er en viktig forsvarsmekanisme som brukes av planter for å bekjempe virale, bakterielle, oomycete og sopppatogener. I sin tur har disse mikrobene utviklet deaktivering suppressor proteiner for å motvirke antiviral deaktivering, og disse RSSs forstyrre ulike trinn av RNA deaktivering sti22,23. Flere screening analyser er utviklet for å identifisere RSSs10.
Her beskriver vi en forbedret protokoll for screening effekteller proteiner utskilt av P. sojae inn i vertscellen ved infeksjon for deres evne til å undertrykke RNA deaktivering i verten. Denne modifiserte analysen er basert på en viral koinfiltrasjonsanalyse, men varierer på flere viktige måter. For det første bør både bakterier og N.benthamiana 16c planter være kraftige og sunne; Dette er svært viktig for stabilt uttrykk for effektorer fra bakteriene og bruk av fullt utviklet N.benthamiana 16c sikrer eksperimentell reproduserbarhet og pålitelighet. Vi bruker ofte bare to eller tre fullt utviklede blader per plante på vegetativ vekststadiet, de gamle og nyoppståtte bladene er uegnet. For det andre må OD600 av bakteriekulturen justeres til en optimal verdi, vanligvis 0,75−1,0 for Agrobacterium. En lavere OD600 (selv så lavt som 0,2) kan brukes til å screene VSRs, men ikke PSRs24. For det tredje må det ideelle tidspunktpunktet for å undersøke grønn fluorescens optimaliseres for hver effektor. I virus, blader co-injisert med kulturer som inneholder GFP pluss antatte VSRs viser en markert økning i grønn fluorescens i infiltrert område på 3 dpi, og signalet forblir høyt til 9 dpi22, men det ble bare utstilt på 4 eller 5 dpi for PSRs i vår nåværende studie. Derfor er det også viktig å ytterligere bekrefte RNA-deaktiveringsaktiviteten ved å kvantifisere akkumuleringen av GFP mRNA. Til slutt er det viktig å bruke riktig kontroll. VSRs er ikke alltid de ideelle positive kontrollene for å identifisere effektellerproteiner fordi disse proteinene har mye sterkere undertrykkende aktivitet enn PSRs. Dette kan føre til manglende evne til å oppdage svake suppressors av RNA-deaktivering.
I denne rapporten demonstrerer vi bruken av vår modifiserte analyse for å screene for suppressors av RNA-deaktivering i Phytophthora og Puccinia graminis patogener. Dermed representerer vår metode et nyttig verktøy for å karakterisere potensielle effektorer som koder RSSs, som fremmer sykdomsmottakelighet ved å hemme liten RNA-akkumulering15,16,17. Derfor tror vi at vår protokoll kan brukes bredt til å screene effektorer utskilt av plantepatogener. Fremtidig arbeid vil fokusere på å identifisere flere RSSs i andre patogener, og på å belyse rollen som RNA-deaktivering i planteforsvar mot invaderende mikrober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra "Shuguang Program" av Shanghai Education Development Foundation og Shanghai Municipal Education Commission, National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 og 31660510), Thousand Talents Program for Young Professionals of China, og Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J.
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D.
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z.
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
