Summary
Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.
Abstract
O silenciamento de RNA é um mecanismo evolutivamente conservado e específico de regulação genética em eucalinos. Vários patógenos vegetais desenvolveram proteínas com a capacidade de inibir o caminho de silenciamento de RNA da planta hospedeira. Ao contrário das proteínas causadoras de vírus, apenas várias proteínas de efeito ou de efeito secreto mostraram a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em patógenos bacterianos, oomycete e fúngicos, e as funções moleculares da maioria dos efetivadores permanecem em grande parte desconhecidas. Aqui, descrevemos em detalhes uma versão ligeiramente modificada do ensaio de co-infiltração que poderia servir como um método geral para observar o silenciamento de RNA e para caracterizar proteínas ou fetos ou fetos segregados por patógenos vegetais. Os principais passos da abordagem são escolher as folhas saudáveis e totalmente desenvolvidas, ajustar a cultura das bactérias à densidade óptica apropriada (OD) a 600 nm, e observar a fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) no momento ideal no infiltrado sai para evitar omitir efetores com fraca atividade de supressão. Este protocolo melhorado contribuirá para uma triagem rápida, precisa e extensiva de supressores de silenciamento de RNA e servirá como um excelente ponto de partida para investigar as funções moleculares dessas proteínas.
Introduction
Nas últimas duas décadas, a aceleração no sequenciamento de genomas de microrganismos que causam doenças vegetais levou a uma lacuna de conhecimento cada vez maior entre informações de sequência e as funções biológicas de proteínas codificadas1. Entre as moléculas reveladas por projetos de sequenciamento estão moléculas que suprimem imunidade inata e facilitam a colonização do hospedeiro; esses fatores são secretados por patógenos vegetais destrutivos, incluindo bactérias, nematoides e micróbios feudos. Para responder a essas ameaças, as plantas hospedeiras desenvolveram novos receptores que reconhecem esses efeitos, permitindo a restauração da resposta imune. Assim, os efetivadores estão sujeitos a diversas pressões seletivas, levando à diversificação de processos ou repertórios entre as linhagens patógenas2. Nos últimos anos, os agentes putativos de patógenos vegetais têm mostrado interromper a imunidade inata da planta, impedindo processos celulares hospedeiros para beneficiar os micróbios de várias maneiras, incluindo a disregulação de caminhos de sinalização, transcrição, transporte intracelular, estabilidade do citoesqueleto, tráfico de vesículos e silenciamento de RNA3,4,5. No entanto, a grande maioria dos patógenos, particularmente os de patógenos filamentous, permaneceram enigmáticos.
O silenciamento de RNA é uma máquina de inativação genética mediada por homologia que é conservada entre eupedia. O processo é desencadeado por longoR de dupla cadeia (dsRNA) e tem como alvo o RNA homônimo de uma única cadeia (ssRNA) de forma específica de sequência, e manipula uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a defesa antiviral6. Para superar as respostas imunes inatas do hospedeiro, alguns vírus evoluíram para compensar o silenciamento de RNA, incluindo a capacidade de se replicar dentro de compartimentos intracelulares ou escapar do sinal reorganizado silenciante. No entanto, a estratégia mais geral pela qual os vírus protegem seus genomas contra a perda dependente de RNA da função genética é codificar proteínas específicas que suprimem o RNA silenciando7,8. Várias abordagens mecanicamente diferentes foram estabelecidas para tela e caracterizam supressores virais de silenciamento de RNA (VSRs), incluindo a co-infiltração de culturas de tumefaciens Agrobacterium, plantas transgênicas expressando supressores putativos, enxerto e cultura celular9,10,11,12,13.
Cada um desses ensaios tem vantagens e desvantagens, e identifica VSRs de sua maneira distinta. Uma das abordagens mais comuns baseia-se na co-infiltração de culturas individuais a. tmuefaciens que abrigam a proteína viral potencial e um gene repórter (tipicamente proteína fluorescente verde [GFP]) nas plantas nicotiana benthamiana 16c constitutivamente expressando GFP o controle do vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor. Na ausência de um supressor viral ativo, o GFP é identificado como exógeno pelas células hospedeiras e é silenciado dentro de 3 dias após a infiltração (dpi). Em contrapartida, se a proteína viral possui atividade de supressão, o nível de expressão do GFP permanece estável além de 3-9 dpi9. Este ensaio de co-infiltração é simples e rápido; no entanto, não é altamente estável nem sensível. No entanto, o ensaio identificou inúmeros VSRs com diversas sequências e estruturas proteicas em muitos vírus RNA7,8.
Recentemente, várias proteínas effectoras que podem inibir a atividade de silenciamento de RNA celular foram caracterizadas a partir de patógenos vegetais bacterianos, oomycete e fúngicos14,15,16. Esses achados implicam que a silenciamento de RNA é uma estratégia comum para facilitar a infecção que é usada por patógenos na maioria dos reinos. Em teoria, muitos, se não todos, dos efetivadores podem codificar supressores de rna silenciando (RSSs); até o momento, porém, apenas alguns foram identificados, principalmente devido à escassez da estratégia de triagem confiável e geral. Além disso, supressores de silenciamento de RNA não foram investigados na grande maioria dos patógenos vegetais17.
Neste relatório, apresentamos um protocolo otimizado e geral para identificar os efeitos de patógenos vegetais que podem suprimir o silenciamento de RNA local e sistêmico usando o ensaio de agroinfiltração. O principal objetivo deste estudo foi enfatizar os aspectos-chave do protocolo e descrever as etapas detalhadas, fornecendo assim um ensaio de triagem adequado para quase todos os efeitos dos patógenos vegetais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todas as etapas do procedimento devem ser realizadas à temperatura ambiente (TR).
ATENÇÃO: Deposite todos os meios de comunicação contendo micróbios patogênicos, bem como as plantas e tecidos vegetais utilizados no ensaio, nos recipientes de resíduos apropriados e autoclave antes de descartar.
1. Preparação de construções plasmáticas contendo efeitos putativos
- Selecione efeitos secretos putativos que são altamente expressos durante a infecção, conforme determinado pelo sequenciamento de RNA (RNA-Seq), e ainda pela técnica quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR).
- Determine o site do decote do peptídeo de sinal de cada effector usando uma ferramenta de software como o SignalP18.
- Projete primers e execute PCR para amplificar o gene codificando o efeito de interesse usando polimerase de DNA de alta fidelidade. Execute a eletroforese de gel de agarose para verificar o produto PCR e, em seguida, clonar o amplicon no vetor de entrada gateway pQBV3 usando o kit de clonagem sem ligação(Tabela de Materiais),e posteriormente no vetor de expressão de destino pEG100 usando a reação de recombinação LR19.
- Transforme 3-5 μL de mistura de reação LR em 100 μL de células E. coli competentes (por exemplo, TOP10, DH5α), espalhe as células bacterianas transformadas em Meio agar Luria-Bertani (LB) complementada com 50 μg/mL kanamicina, e incubar a 37 °C por 16-20 h.
NOTA: Os transformantes positivos podem ser identificados pela colônia PCR20 e analisados por miniprep e sequenciamento plasmáticos. - Introduza 50-100 ng de plasmídeos recombinantes transportando proteína sucroável em 100 μL de células A. tumefaciens quimicamente competentes (por exemplo, GV3101 ou C58C1), misture suavemente e, em seguida, congele em nitrogênio líquido por 1 min. Descongele as células em um banho de água de 37 °C por 5 min.
- Adicione 500 μL de caldo LB e incuba a 30 °C para 4-6 h com agitação suave, e depois transfira e espalhe todas as células de agrobactérias em meio LB agar complementado com 50 μg/mL kanamycin e 50 μg/mL rifampicina a 30 °C por 2 dias.
NOTA: Clones positivos podem ser verificados pela colônia PCR. - Use uma única colônia transformada para experimentos de agroinfiltração, a menos que seja dirigido de outra forma.
NOTA: Na presente pesquisa, nenhum dos genes realizadores testados continha intronas previstas; cada um dos genes foi diretamente amplificado a partir de DNA genômico de um isolado fitophthora sojae. Recomenda-se um vetor de expressão de planta Gateway sem qualquer etiqueta, mas não necessário.
2. Preparação de plantas N. benthamiana 16c
- Prepare misturas de solo de vasos constituídas por (por volume) 50% de musgo de turfa, 30% perlite e 20% vermiculite, e autoclave a 120 °C por 20 min.
- Misture o solo autoclavo com solução de fertilizante vegetal (1 g/L) e subembaem em potes menores (80 mm x 80 mm x 75 mm) armazenados em uma bandeja maior (540 mm x 285 mm x 60 mm).
- Semea uma ou duas sementes de N. benthamiana 16c na superfície do solo de cada panela. Cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e deixe as sementes germinarem.
- Coloque a bandeja câmaras de crescimento leves e controladas pela temperatura com temperatura de 23-25 °C, 50-60% umidade relativa e um período de fotoperiod de longo dia (14h claro/10h escuro, com iluminação de 130-150 μE·m-2s-1).
- Tire a cúpula de plástico após o germinar as sementes (3-4 dias) e permita que as mudas cresçam as mesmas condições utilizadas para a etapa de germinação.
- Adicione uma quantidade adequada de água, mantendo o solo úmido, mas não encharcado, a cada 2-3 dias; adicionar fertilizante a cada 10 dias para promover um crescimento adicional. Mantenha as plantas N. benthamiana 16c em condições normais até estarem prontas para uso; nesta fase, a planta deve ter pelo menos cinco folhas verdadeiras totalmente desenvolvidas e nenhum axillário visível ou brotos de flores, e as folhas devem ter uma aparência verde saudável).
- Use folhas de 3 a 4 semanas de N. benthamiana 16c para ensaios locais de silenciamento de RNA, e as plantas jovens N. benthamiana 16c (10-14 dias de idade) para ensaios sistêmicos de silenciamento de RNA.
NOTA: As condições e instalações de crescimento das plantas variam entre laboratórios; escolher folhas saudáveis, bem desenvolvidas e totalmente expandidas para infiltração.
3. Preparação da cultura Agrobacterium para infiltração
- Escolha uma colônia positiva da placa LB e inocule as células em tubo de vidro contendo 5 mL de meio LB complementado com 50 μg/mL kanamicina e 50 μg/mL rifampicina. Cresça as células a 30 °C com tremor a 200 rpm por 24-48 h.
- Transfira 100 μL de cultura para 5 mL de meio LB complementado com mesmos antibióticos, 10 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES; pH 5.6) e 20 μM acetosyringononona (AS). Cresça bactérias a 30 °C com tremor a 200 rpm por 16-20 h.
- Células centrífugas a 4.000 x g por 10 min. Despeje o supernatante e resuspenda a pelota em 2 mL de 10 mM MgCl2 tampão.
- Repita o passo 3.3 para garantir a remoção completa dos antibióticos.
- Determine a densidade da cultura Agrobacterium medindo a densidade óptica em 600 nm (OD600). Ajuste-se a um OD600 de 1,5-2.0 com tampão MgCl2 de 10 mM.
- Adicione 10 mM MES (pH 5.6) e 150 μM AS às culturas finais de suspensão e incuba as células na RT por pelo menos 3 h sem tremer.
NOTA: Não deixe as culturas finais de suspensão durante a noite.
4. Co-infiltração N. benthamiana folhas
- Misture volumes iguais de uma cultura Agrobacterium contendo 35S-GFP com uma cultura Agrobacterium contendo 35S- supressor de vírus de mosaico de pepino 2b (CMV2b), efeito putativo ou vetor vazio (EV).
- Cuidadosamente e lentamente, infiltrar-se nas suspensões mistas de agrobacterium nos lados abaxiais das folhas n. benthamiana 16c usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
- Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com limpadores de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com uma caneta fabricante.
- Deixe as plantas infiltradas na câmara de crescimento as mesmas condições de crescimento.
NOTA: Por razões de segurança e saúde, óculos de proteção e uma máscara devem ser usados durante a infiltração. Para evitar a contaminação cruzada, as luvas devem ser trocadas ou esterilizadas com etanol entre infiltrações. Normalmente, pelo menos 1 mL de suspensões de agrobacterium por folha é necessário para infiltração. Para silenciamento sistêmico, pelo menos duas folhas serão necessárias para infiltração.
5. Análise de imagem gfp
- Detecte visualmente fluorescência gfp em folhas recém-cultivadas de plantas inteiras 2 semanas após a infiltração (para silenciamento sistêmico de RNA) ou manchas infiltradas de folhas 3-4 dpi usando uma lâmpada ultravioleta de ondas longas (UV) sem a coleta de folhas.
- Fotografe plantas coletadas e/ou folhas separadas com uma câmera digital equipada com filtros UV e amarelo.
NOTA: Para ensaios de silenciamento local, investigue remendos infiltrados de folhas n. benthamiana 16c, enquanto para atividade sistêmica de silenciamento, investigue folhas recém-cultivadas. A atividade de supressão de silenciamento de RNA pode variar entre os efeitos individuais. Portanto, observe as manchas ou folhas ao longo de alguns dias a partir de 3 dpi. Use CMV2b e EV como controles positivos e negativos, respectivamente.
6. Análise de manchas norte dos níveis de GFP mRNA em folhas infiltradas
- Isolamento do RNA total do tecido folha usando o reagente de isolamento rna (Tabela de Materiais)
- Colete tecidos de folhas de manchas infiltradas n. benthamiana 16c a 4-7 dpi, pulverizar em nitrogênio líquido para um pó fino e transferir o pó para um tubo estéril de 2 mL.
- Adicione o reagente de isolamento rna (1 mL/100 mg tecidual) imediatamente ao tubo amostrado em um capô, agite vigorosamente para homogeneizar e incubar na RT por 5 min.
- Adicione clorofórmio (200 μL/1 mL RNA reagente de isolamento) a cada tubo em um capô, agite vigorosamente por 15 s e incuba r 5 min. Centrífuga o homogeneado a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Transfira o supernatant para um novo tubo livre de RNase e descarte a pelota. Adicione 0,7 volume de isopropanol ao supernatante, inverta delicadamente várias vezes e incuba a mistura na RT por 10 minutos.
- Precipitar a pelota de RNA por centrífuga em 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Descarte o supernatante, lave a pelota com 70% de etanol e seque a pelota em um capô. Dissolva o RNA em água tratada com pirocarbonato diethyl (DEPC) incubando em um banho de água de 65 °C por 10-20 min.
- Análise de manchas norte do nível de GFP mRNA nas folhas infiltradas
- Prepare um gel de agarose de dedenação de formaldeído de 1,2% em 1x mops tampão de execução.
- Misture rna 1:1 com tintura de carregamento de RNA e denatureza por incubação a 65 °C por 10 min, esfrie imediatamente as amostras desnaturadas no gelo por 1 min.
- Carregue as amostras no gel e eletroforese a 100 V por 50 min até que o RNA esteja bem separado.
- Enxágüe o gel em 20x tampão de citrato salino-sódio (SSC) para remover formaldeído e transfira o gel para membrana de nylon por transferência capilar em tampão SSC de 20x durante a noite. Mergulhe a membrana em 2x SSC e fixe o RNA na membrana expondo a membrana molhada à ligação da cruz UV.
- Adicione a quantidade apropriada de tampão de hibridização (10 mL por membrana de 100 cm2; Tabela de Materiais) em um tubo de hibridização e agitar a 60 °C em um forno de hibridização.
- Coloque a membrana no tubo de hibridização e incuba por 60 min a 60 °C. Diluir uma sonda de DNA com rótulo DIG de 5'DIG (concentração final, 50 ng/mL) na solução de hibridização contendo tampão de hibridização pré-aquecido.
- Descarte o buffer de pré-hibridização e substitua imediatamente por uma solução de hibridização pré-aquecida contendo a sonda rotulada dig. Incubar a mancha com sonda a 60 °C durante a noite, com agitação suave.
- Após a hibridização, lave a membrana duas vezes em buffers de cada fio de 60 °C por 20 min cada. Limpe delicadamente a membrana para remover o tampão extra de lavagem e adicione reagentes conforme sugerido no kit de hibridização e detecção quimiologo(Tabela de Materiais).
- Detecte sinais hibridizados pela reação quimiológica combinada com o sistema de imagem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acima, descrevemos o procedimento passo a passo para um melhor ensaio de triagem para avaliar a atividade RSS dos effectores P. sojae RxLR. Ao todo, o experimento leva de 5 a 6 semanas. Posteriormente, os RSSs identificados pelo ensaio podem ser ainda mais caracterizados em termos de função e mecanismo molecular. Como exemplo de nossa abordagem, usamos o supressor P. sojae RxLR do Silencing RNA 1 (PSR1), que é secretado e entregue em células hospedeiras através da haustoria durante a infecção.
Para confirmar que o PSR1 tem atividade RSS e, portanto, adequado para este método, cada cepa de agrobacterium transformada foi misturada com uma cepa que abrigava 35S-GFP e foi infiltrada em folhas de N. benthamiana 16c. EV e CMV2b foram utilizados como controles negativos e positivos, respectivamente (Figura 1). A expressão gfp atingiu o nível mais alto em folhas infiltradas com todas as misturas em 2-3 dpi. A intensidade da fluorescência verde permaneceu forte em patches co-infiltrados com 35S-GFP mais CMV2b durante um período de observaçãode6-9 dias . A coinfiltração do GFP com psr1 também resultou em fluorescência gfp mais forte durante um período de observações de 3,5-4,5 dias, como demonstrado pela fluorescência elevada nas manchas infiltradas. No entanto, a intensidade da fluorescência em patches infiltrados com 35S-GFP e EV enfraqueceu em 3 dpi. Em 4-5 dpi, a fluorescência gfp era pouco detectável (Figura 1).
O blot norte revelou que o GFP mRNA acumulou mais nas folhas expressando 35S-GFP mais 35S-CMV2b ou 35S-GFP mais 35S-PSR1 do que nas folhas expressando 35S-GFP mais EV(Figura 2). Assim, a expressão transcricional do PSR1, bem como cmV2b contribuíram para a estabilização do GFP mRNA, o que resultou em fluorescência gfp elevada.
Também usamos o ensaio de agroinfiltração para avaliar a disseminação do sinal de silenciamento nas folhas de mudas n. benthamiana de 16c de 2 semanas de idade. Para isso, geralmente selecionamos 3-4 folhas maiores para injeção de folhas inteiras. Com 14 dpi, mais de 98% do EV exibiu evidente sinalização gfp em folhas sistêmicas, enquanto tanto psR1 quanto CMV2b inibiram eficientemente a disseminação sistêmica do sinal de silenciamento observando a fluorescência gfp em cerca de 80% das plantas co-infiltradas, e nos 20% restantes das plantas infiltradas com apenas algumas veias vermelhas apareceram em folhas recém-emergidas (Figura 3).
Figura 1: Phytophthora sojae RxLR effector PSR1 suprime rna local silenciando em Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) 16c plantas. Folhas totalmente desenvolvidas de usinas n. benthamiana 16c (painel esquerdo) foram co-infiltradas em patches com misturas agrobacterium carregando 35S-GFP e as construções indicadas acima de cada imagem. A fluorescência gfp da área infiltrada foi imagensob luz natural (painel médio) e luz UV de ondas longas (painel direito) a 4 dpi. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. As flechas vermelhas representam folhas infiltradas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Acúmulo de GFP mRNA em folhas infiltradas n. benthamiana 16c. CK e EV representam N. benthamiana 16c folhas sozinhas e 16c folhas co-infiltradas com 35S-GFP mais EV. As amostras de EV e CMV2b foram utilizadas como controles negativos e positivos, respectivamente. Além disso, o rRNA foi usado como controle de carregamento. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: P. sojae RxLR effector PSR1 suprime o silenciamento sistêmico de RNA em plantas n. benthamiana 16c. Três ou quatro folhas de mudas n. benthamiana 16c (painel esquerdo) foram co-infiltradas transitóriamente pela Agrobacterium abrigando 35S-GFP e EV ou vetor expressando PSR1 ou CMV2b do promotor 35S. A fluorescência gfp de folhas recém-cultivadas foi imaged luz natural (painel superior) e luz UV de ondas longas (painel inferior) a 14 dpi. Este experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. Flechas vermelhas indicavam folhas infiltradas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O silenciamento de RNA é um mecanismo de defesa chave empregado pelas plantas para combater patógenos virais, bacterianos, oomycete e fúngicos. Por sua vez, esses micróbios evoluíram silenciando proteínas supressoras para neutralizar o silenciamento antiviral, e esses RSSs interferem em diferentes etapas da via de silenciamento rna22,23. Vários ensaios de triagem foram desenvolvidos para identificar rsss10.
Aqui, descrevemos um protocolo aprimorado para o rastreamento de proteínas ou proteínas secretadas pela P. sojae na célula hospedeira sobre a infecção por sua capacidade de suprimir o silenciamento de RNA no hospedeiro. Este ensaio modificado é baseado em um ensaio de co-infiltração viral, mas difere de várias maneiras importantes. Primeiro, tanto as plantas de bactérias quanto n.benthamiana 16c devem ser vigorosas e saudáveis; isso é muito importante para a expressão estável de efeitos das bactérias e o uso de N.benthamiana 16c totalmente desenvolvida garante a reprodutibilidade experimental e confiabilidade. Muitas vezes usamos apenas duas ou três folhas totalmente desenvolvidas por planta na fase de crescimento vegetativo, as folhas antigas e recém-emergidas são inadequadas. Em segundo lugar, o OD600 da cultura bacteriana deve ser ajustado a um valor ideal, geralmente 0,75-1.0 para a Agrobacterium. Um OD600 mais baixo (mesmo tão baixo quanto 0,2) pode ser usado para tela VSRs, mas não PSRs24. Em terceiro lugar, o ponto de tempo ideal para investigar a fluorescência verde deve ser otimizado para cada efetivador. No vírus, as folhas coinjetadas com culturas contendo GFP mais VSRs putativos exibem um aumento acentuado da fluorescência verde na área infiltrada em 3 dpi, e o sinal permanece alto até 9 dpi22,mas só foi exibido em 4 ou 5 dpi para PSRs em nosso presente estudo. Por isso, também é importante confirmar ainda mais a atividade de silenciamento de RNA, quantificar o acúmulo de GFP mRNA. Por fim, é essencial usar o controle adequado. Os VSRs nem sempre são os controles positivos ideais para identificar proteínas eficazes ou de efeito, porque essas proteínas têm atividade supressiva muito mais forte do que os PSRs. Isso pode resultar em falha na detecção de supressores fracos de silenciamento de RNA.
Neste relatório, demonstramos o uso de nosso ensaio modificado para tela para supressores de rna silenciando em patógenos Phytophthora e Puccinia graminis. Assim, nosso método representa uma ferramenta útil para caracterizar potenciais efeitos que codificam RSSs, que promovem a suscetibilidade da doença inibindo o pequeno acúmulo de RNA15,16,17. Portanto, acreditamos que nosso protocolo poderia ser usado amplamente para rastrear agentes secretos por patógenos vegetais. O trabalho futuro se concentrará na identificação de mais RSSs em outros patógenos e na elucidação do papel do RNA silenciando na defesa vegetal contra micróbios invasores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do "Programa Shuguang" da Fundação de Desenvolvimento educacional de Xangai e da Comissão Municipal de Educação de Xangai, do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da Chave Nacional da China ( 2018YFD0201500), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31571696 e 31660510), o Programa Mil Talentos para Jovens Profissionais da China e a Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (18DZ2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J.
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D.
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z.
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
