Summary

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

Published: March 30, 2020
doi:

Summary

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

Abstract

הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית על formalin-קבוע פרפין מוטבע (FFPE) רקמות מאפשר זיהוי של סמנים מרובים מדגם רקמה אחת שיכולה לספק מידע על אנטיגן הביטוי והפצה מרחבית של סמנים. עם זאת, חוסר נוגדנים מתאים עבור הרקמות הקבועות של formalin עשוי להגביל את האופי של סמנים כי ניתן לזהות. בנוסף, שיטת הצביעת היא גוזלת זמן. כאן אנו מתארים שיטה מהירה לבצע הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטרלי על רקמות קפואות. השיטה כוללת את שילובי fluorophore בשימוש, צעדים מפורטים עבור כתמים של העכבר ורקמות קפואות האדם, ואת הסריקה, רכישה, וניתוח הליכים. לניתוח מכתים, מערכת הדמיה פלואורסצנטית מסחרית ומרובת כלים למחצה. באמצעות שיטה זו, עד שישה סמנים שונים היו ויטראז וזוהו בסעיף אחד הרקמה הקפואה. תוכנת ניתוח למידה של מחשב יכול להתאים את התאים שניתן להשתמש בהם עבור ניתוח כמותי. השיטה המתוארת כאן עבור הרקמות הקפואות היא שימושית לאיתור סמנים שלא ניתן לאתרם ברקמות FFPE או באילו נוגדנים אינם זמינים עבור רקמות FFPE.

Introduction

ההתפתחויות האחרונות בטכניקות דימות מיקרוסקופיים שיפרו באופן משמעותי את הידע שלנו וההבנה של תהליכים ביולוגיים ומצבי מחלה. באיתור באתרו של חלבונים ברקמות באמצעות כרומוגניים אימונוהיסטוכימיה (IHC) מבוצעת באופן שגרתי בפתולוגיה. עם זאת, זיהוי של סמנים מרובים באמצעות כיפוגניים IHC כתמים הוא מאתגר1 ושיטות חדשות יותר להשתמש מערכות משנה החיסונית (mif) צביעת גישות, שבו סמנים ביולוגיים מרובים מתויגים על דגימת רקמה אחת, מפותחים. הזיהוי של סמנים ביולוגיים מרובים הוא שימושי, כי מידע הקשור לארכיטקטורת רקמות, התפלגות מרחבית של תאים, ו אנטיגן שיתוף ביטוי כולם נלכדים בדגימת רקמה אחת2. השימוש בטכנולוגיית הדמיה של קרינה פלואורסצנטית רב-ספקטרלית הפכה את הגילוי של סמנים ביולוגיים מרובים אפשריים. בטכנולוגיה זו, באמצעות אופטיקה ספציפית ספקטרום הקרינה הפלואורסצנטית של כל fluorophore הפרט יכול להיות מופרדים או “unmixed עורב”, המאפשר זיהוי של סמנים מרובים ללא כל הצלבות ספקטרלית3. הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית הופכת לגישה קריטית בביולוגיה של התא, פיתוח תרופות טרום-קלינית, פתולוגיה קלינית, והגידול בפרופיל החיסוני4,5,6. חשוב מכך, התפלגות מרחבי של תאים חיסוניים (במיוחד CD8 T תאים) יכול לשמש גורם התחזיות עבור חולים עם גידולים קיימים7.

הגישות השונות לצביעת מולטיפלקס פותחו וניתן לבצעו בו או ברצף. בשיטת הצביעה הסימולטנית, כל הנוגדנים מתווספים יחד כקוקטייל בשלב אחד כדי לתייג את הרקמה. טכנולוגיית UltraPlex משתמשת בקוקטייל של נוגדנים ראשוניים הצוכעשר מעלה ואחריו קוקטייל של fluorophore מעלה נגד הפגוטן נוגדנים משניים. טכנולוגיית Inממקם ב8 משתמש בקוקטייל ייחודי DNA-מצוסד נוגדנים ראשוניים אשר מתווספים בו לרקמות ואחריו צעד הגברה ולבסוף fluorophore-מעלה בדיקות כי הם משלימים כל רצף DNA ייחודי על הנוגדן העיקרי. שתי הטכנולוגיות הללו מאפשרות זיהוי של ארבעה סמנים פלוס 4, 6-diamino-2-פניינידול (DAPI) עבור כתמים גרעיניים. שתי גישות נוספות לצביעת בתים בו מבוססות על מאסה משנית בספקטרומטר היונים9. מערכת הדמיה Hyperion משתמשת הדמיה המסה cy, לנסות10 כדי לזהות עד 37 סמנים. טכנולוגיה זו משתמשת בקוקטייל של נוגדנים מצוחים מתכת כדי להכתים את הרקמות, ואזורים ספציפיים של הרקמות הם מהונן על ידי לייזר והועבר cytometer המוני היכן יוני מתכת מזוהים. טכנולוגיה דומה נוספת היא IONPath, המשתמשת בטכנולוגיית הדמיה של קרן יון ממותגת11. טכנולוגיה זו משתמשת בכלי משתמש בספקטרומטר מסה ובמקור של מקור חמצן במקום לייזר כדי להשתמש בנוגדנים בעלי מתכת. בעוד כל הגישות הללו בו מכתים במקביל לאפשר זיהוי של סמנים מרובים, העלויות הכרוכות ב-DNA, הפעשרות, או מתכות לנוגדנים, אובדן רקמות בשל אבלציה, ואת עיבוד תמונה נרחבת עבור חוסר ערבוב לא ניתן להמעיט. יתר על כן, ערכות ופרוטוקולים כתמים זמינים כרגע רק עבור רקמות FFPE ופיתוח פאנלים מותאמים אישית כרוך בזמן נוסף והוצאות.

לעומת זאת, השיטה הרציפה מכתימה את הרקמה עם נוגדן לסמן אחד, בנוכחות להסיר את הנוגדן, ואחריה רצף חוזר של תהליך זה כדי לתייג סמנים מרובים12. הגברה של האות (ת א) היא השיטה הרציפה ביותר לשימוש הרציף. שתי טכנולוגיות ריבוב אחרות משתמשות בשילוב של שיטות מכתים בו ורציפות. בפלטפורמת הקודקס13 מועסקים קוקטייל של נוגדנים מצוהרים לרצפי דנ א ייחודי של ה-DNA שנוצרו בסופו של דבר עם פלואורוופפור באמצעות צעד הפלמור באינדקס ואחריו הדמיה, להתפשט, וחוזר על התהליך כדי לזהות עד 50 סמנים. מולטימיקו Multix מכתים את הגישה14 הוא איטרציה של כתמים עם קוקטייל של שלושה עד ארבעה fluorophore נוגדנים מצוהרים, הדמיה, מקוצ’ינג את fluorophores, וחוזר על מחזור זה כדי לזהות עד 60 סמנים על מקטע אחד. בדומה לשיטת הצביעה הסימולטנית, בעוד שניתן לזהות מגוון רחב של סמנים, הזמן המעורב בצביעת, רכישת תמונות, עיבוד וניתוח הוא נרחב. הצעד להתפשט/מקוצ’ינג כרוך חימום ו/או הלבנת דגימת הרקמה ולכן, הגישה הרציפה מכתים מתאים בדרך כלל על רקמות FFPE השומרים על שלמות הרקמה על חימום או הלבנה.

קיבעון formalin והטבעה של פרפין בהמשך מבוצע בקלות בהגדרה קלינית, בלוקים רקמות קל לאחסן, ומספר פרוטוקולים מכתים כתמים זמינים. עם זאת, עיבוד, הטבעה, והאחלות של רקמות FFPE, כמו גם לאחזור אנטיגן15, תהליך שבו הנוגדנים יכולים לגשת לאפיסקופים יותר, היא גוזלת זמן. יתר על כן, עיבוד מעורב ברקמות ffpe תורם אוטומטי של16 ומסכות היעד אפיסקופים, וכתוצאה מכך השונות וחוסר שיבוט נוגדן זמין כדי לזהות אנטיגנים ברקמות ffpe17,18,19. דוגמה לכך היא אנטיגן הלוקוציט האנושי (HLA) הכיתה ה-20. לעומת זאת, הקפאה הצמד של הרקמות אינו כרוך שלבי עיבוד נרחב לפני או אחרי תיקון, לעקוף את הצורך אחזור אנטיגן21,22, ועושה את זה מועיל לגילוי מגוון רחב יותר של מטרות. לכן, באמצעות רקמות קפואות עבור הדמיה פלואורסצנטית רב-ספקטרלית יכול להיות יקר כדי לזהות מטרות עבור מחקרים פרה-קליניים וקליניים.

בהינתן המגבלות שהוזכרו לעיל בעת שימוש ברקמות FFPE, שאלנו אם הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית ניתן לבצע על רקמות קפואות. כדי לענות על שאלה זו, בדקנו את השיטה בו מכתים בו באמצעות פאנל של שיטת fluorophore-מעלה נוגדנים כדי לזהות אנטיגנים מרובים וניתח את הצביעת באמצעות מערכת הדמיה מרובת ספקטרלית חצי אוטומטי. הצלחנו להכתים בו שישה סמנים בסעיף אחד ברקמה בתוך 90 דקות.

Protocol

הטחול של העכבר ורקמות הגידול של העכבר HLF1623 התקבלו מהמעבדה שלנו. רקמת השומן האנושית נרכשה מספק מסחרי. פרטים מסופקים ברשימת החומרים. 1. הטמעת רקמות הטמע רקמות טריות ב-OCT (טמפרטורת חיתוך אופטימלית) והקפא הקפאה באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי. אחסון …

Representative Results

זיהוי סמנים חד-מוכתמים במקטעי טחול קפואיםכמו מערכת הדמיה למחצה אוטומטית משתמשת מסנן גביש נוזלי tunable (מערכת ליקוויד TF) המאפשר מגוון רחב יותר של גילוי אורך הגל25, ומשום שאין שלבי הגברה האות בוצעו כאן, אנו הראשון אופטימיזציה של הזיהוי של נוגדנים הראשי שלנו מצופנים עבור…

Discussion

הרקמות הקפואות השתמשו בהרחבה עבור הדמיה mIF כדי לזהות באופן מסורתי שלושה עד ארבעה סמנים31 על רקמה באמצעות שיטה ישירה ועקיפה32. בשיטה ישירה, נוגדנים הם מצוענים צבעים רואה או נקודות הקוונטים33 לתווית את הרקמה, ואילו בשיטה עקיפה, נוגדן ראשוני מצומת משמש לתי…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

הדרכה הדמיה וניתוח סופקו על ידי מרכז משאבי מחקר – מחקר היסטולוגיה ודימות רקמות הליבה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו הוקמה עם תמיכה מהמשרד של סגן הקנצלר למחקר. העבודה נתמכת על ידי NIH/NCI RO1CA191317 to CLP, על ידי NIH/NIAMS (SBDRC מענק 1P30AR075049-01) כדי ד ר א. Paller, ועל ידי תמיכה של רוברט לוריא מקיף סרטן המרכז להערכת הליבה חיסוני באוניברסיטת נורת’ווסטרן.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

Riferimenti

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Ricerca sul cancro. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Play Video

Citazione di questo articolo
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

View Video