凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法
Summary
凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。
Abstract
ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織上のマルチスペクトル蛍光イメージングは、抗原共発現およびマーカーの空間分布に関する情報を提供できる単一の組織サンプル内の複数のマーカーの検出を可能にする。しかしながら、ホルマリン固定組織に対する適切な抗体の欠如は、検出できるマーカーの性質を制限する可能性がある。また、染色方法は時間がかかります。ここでは、凍結組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行う迅速な方法について説明する。この方法には、使用されるフルオロフォアの組み合わせ、マウスおよびヒト凍結組織の染色に関する詳細なステップ、およびスキャン、取得、および分析手順が含まれる。染色解析には、市販の半自動マルチスペクトル蛍光イメージングシステムが使用されている。この方法を通じて、1つの凍結組織セクションで最大6つの異なるマーカーが染色され、検出された。機械学習解析ソフトウェアは、定量分析に使用できる表現型細胞を使用できます。ここで説明する凍結組織の方法は、FFPE組織では検出できないマーカーや、FFPE組織に対して抗体が利用できないマーカーの検出に有用である。
Introduction
顕微鏡イメージング技術の最近の進歩は、生物学的プロセスおよび疾患状態に関する我々の知識と理解を大幅に向上させました。染色原性免疫組織化学(IHC)を介した組織中のタンパク質のインサイチュ検出は、病理において日常的に行われている。しかし、発泡IHC染色を用いた複数のマーカーの検出は、1つ以上の新しい方法で多重免疫蛍光(mIF)染色法を用い、複数の生物学的マーカーが単一の組織サンプル上に標識され、開発されている。複数の生体マーカーの検出は、組織アーキテクチャ、細胞の空間分布、および抗原共発現に関する情報がすべて単一の組織試料2に捕捉されるため有用である。マルチスペクトル蛍光イメージング技術を用いることが、複数の生物学的マーカーの検出を可能にしました。この技術では、個々の蛍光色素の蛍光スペクトルを個別の蛍光スペクトルに特異的な光学を用いて、分離したり「混合しない」と、スペクトルクロストーク3を一切起らなく複数のマーカーを検出することを可能にする。マルチスペクトル蛍光イメージングは、細胞生物学、前臨床薬の開発、臨床病理学、および腫瘍免疫プロファイリング44、5、65,6において重要なアプローチになりつつある。重要なことに、免疫細胞(具体的にはCD8 T細胞)の容量分布は、既存の腫瘍7を有する患者の予後因子として機能し得る。
多重蛍光染色に対する様々なアプローチが開発されており、同時または順次に行うことができます。同時染色法では、すべての抗体をカクテルとして一回のステップで添加し、組織にラベルを付けます。UltraPlex技術は、ハプテン共役一次抗体のカクテルに続いて、フルオロフォア共役抗ハプテン二次抗体のカクテルを使用します。InSituPlex技術8は、組織に同時に付加されるユニークなDNA共役一次抗体のカクテルを使用し、その後に増幅ステップを行い、最後に一次抗体上の各固有DNA配列を補完するフルオロフォア共役プローブを用いる。これらの技術は、4つのマーカーに加えて、核染色のための4′,6-diamino-2-フェニリンドール(DAPI)を検出することを可能にする。同時多重染色のための他の2つのアプローチは、二次イオン質量分析9に基づいています。Hyperion Imaging システムは、イメージング質量サイトメトリー10を使用して、最大 37 個のマーカーを検出します。この技術は、組織を染色するために金属共役抗体のカクテルを使用し、組織の特定の領域はレーザーによってアブレートされ、金属イオンが検出される質量サイトメーターに移されます。もう一つの同様の技術は、多重化イオンビームイメージング技術11を使用するIONPathです。この技術は、金属共役抗体をアブラクトするためにレーザーの代わりに、変性質量分析計装置と酸素イオン源を使用します。これらすべての同時多重染色法により、複数のマーカーの検出が可能になりますが、DNA、ハプテン、または金属を抗体に結合するためのコスト、アブレーションによる組織の喪失、および混合解除のための広範な画像処理を過小評価することはできません。さらに、キットおよび染色の議定書はFFPEティッシュのために現在だけ利用でき、カスタムパネルを開発することは付加的な時間および支出を伴う。
シーケンシャル多重染色法には、対照的に、抗体を用いた組織を1つのマーカーに標識し、除去して抗体を除去し、続いてこのプロセスの逐次反復を行い、複数のマーカー12を標識する。このチラミド信号増幅(TSA)は、最も頻繁に使用される逐次多重化法である。他の2つの多重化技術は、同時染色法と逐次染色法の組み合わせを使用します。CODEXプラットフォーム13は、インデックス化された重合ステップを使用して最終的にフルオロフォアで標識されるユニークなDNAオリゴヌクレオチド配列に結合した抗体のカクテルを採用し、その後、最大50個のマーカーを検出するプロセスを繰り返します。MultiOmyx多重染色アプローチ14は、3〜4個のフルオロフォア共役抗体のカクテルで染色し、イメージング、蛍光ホルを焼入れ、このサイクルを繰り返して単一のセクションで最大60個のマーカーを検出する反復である。同時多重染色法と同様に、広範囲のマーカーを検出できる一方で、染色、画像取得、処理、および分析に関わる時間は広範囲に及ぶ。ストリッピング/クエンチングステップは、組織サンプルの加熱および/または漂白を伴い、加熱または漂白時に組織の完全性を維持するFFPE組織に対してシーケンシャルな多重染色アプローチが一般的に行われます。
ホルマリン固定およびそれに続くパラフィン埋め込みは臨床現場で容易に行われ、組織ブロックは保存しやすく、複数の多重染色プロトコルが利用可能である。しかしながら、FFPE組織の処理、埋め込み、および脱パラフィン化、ならびに抗原検索15は、抗体がエピトープに良好にアクセスできるプロセスに、時間がかかる。さらに、FFPE組織に関与する処理は、自己蛍光16およびマスク標的エピトープに寄与し、FFPE組織17、18、1918,19における抗原を検出するために利用可能な抗体クローンのばら17つきおよび欠如をもたらす。例としては、ヒト白血球抗原(HLA)クラスIアレル20である。対照的に、組織のスナップ凍結は、固定前または後に広範な処理ステップを伴わない、抗原検索21、22の必要性を回避し、22より広い範囲の標的を検出するのに有益である。したがって、マルチスペクトル蛍光イメージングに凍結組織を用い、前臨床および臨床研究の標的を検出する価値がある。
FFPE組織を用いた上述の制限を踏まえると、冷凍組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行うことができるかどうか尋ねた。この問題に対処するため、複数の抗原を検出するフルオロフォア共役抗体のパネルを用いて同時多重染色法を試験し、半自動マルチスペクトルイメージングシステムを用いて染色を解析した。90分以内に1つの組織セクションで最大6つのマーカーを同時に染色することができました。
Protocol
Representative Results
Discussion
凍結組織は、従来から直接的および間接的な方法32を用いて組織上の3〜4個のマーカー31を検出するmIFイメージングに広く使用されてきた。直接法では、抗体は組織を標識するために蛍光色素または量子ドット33に結合し、一方、間接的な方法では、組織に対して一次抗体を特異的に認識するフルオロフォア共役二次抗体が続く組織を標識?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
イメージングと分析のガイダンスは、イリノイ大学シカゴ校の研究資料研究センター、研究組織イメージングコアによって提供され、研究担当副首相の事務所の支援を受けて設立されました。この研究は、NIH/NCI RO1CA191317からCLP、NIH/NIAMS(SBDRCはA.パラー博士に対して1P30AR075049-01)、ロバート・H・ルーリー総合がんセンターのノースウェスタン大学免疫療法評価コアの支援によって支えられた。
Materials
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone – 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone – L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone – UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone – C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone – C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone – GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1X | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone – M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1X | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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