Summary

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Published: March 30, 2020
doi:

Summary

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Abstract

Imagens multiespectrais de fluorescência em tecidos parafina-fixados em parafina (FFPE) permitem a detecção de múltiplos marcadores em uma única amostra de tecido que pode fornecer informações sobre coexpressão de antígeno e distribuição espacial dos marcadores. No entanto, a falta de anticorpos adequados para tecidos formalin-fixos pode restringir a natureza dos marcadores que podem ser detectados. Além disso, o método de coloração é demorado. Aqui descrevemos um método rápido para realizar imagens de fluorescência multiespectral em tecidos congelados. O método inclui as combinações de fluoróforos utilizadas, etapas detalhadas para a coloração de camundongos e tecidos congelados humanos e os procedimentos de varredura, aquisição e análise. Para análise de coloração, é utilizado um sistema de imagem multiespectral multiespectral semiautomatizado disponível comercialmente. Através deste método, até seis marcadores diferentes foram manchados e detectados em uma única seção de tecido congelado. O software de análise de aprendizado de máquina pode fenótipo células que podem ser usadas para análise quantitativa. O método descrito aqui para tecidos congelados é útil para a detecção de marcadores que não podem ser detectados em tecidos FFPE ou para os quais os anticorpos não estão disponíveis para os tecidos FFPE.

Introduction

Os recentes avanços em técnicas de imagem microscópica melhoraram significativamente nosso conhecimento e compreensão dos processos biológicos e estados de doenças. In situ detecção de proteínas em tecidos via imunohistoquímica cromogênica (IHC) é realizada rotineiramente na patologia. No entanto, a detecção de múltiplos marcadores usando a coloração cromogênica do IHC está desafiando1 e métodos mais novos para usar abordagens de coloração multiplex imunofluorescência (mIF), onde vários marcadores biológicos são rotulados em uma única amostra de tecido, estão sendo desenvolvidos. A detecção de múltiplos marcadores biológicos é útil, pois as informações relacionadas à arquitetura tecidual, distribuição espacial das células e co-expressão de antígenos são capturadas em uma única amostra de tecido2. O uso da tecnologia de imagem de fluorescência multiespectral tornou possível a detecção de múltiplos marcadores biológicos. Nesta tecnologia, utilizando óptica específica, o espectro de fluorescência de cada fluoróforo individual pode ser separado ou “não misturado”, permitindo a detecção de múltiplos marcadores sem qualquer crosstalk espectral3. A imagem de fluorescência multiespectral está se tornando uma abordagem crítica na biologia celular, desenvolvimento de fármacos pré-clínicos, patologia clínica e perfil imunológico do tumor4,5,6. É importante ressaltar que a distribuição espaçada das células imunes (especificamente as células CD8 T) pode servir como fator prognóstico para pacientes com tumores existentes7.

Várias abordagens para a coloração de fluorescência multiplex foram desenvolvidas e podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente. No método de coloração simultânea, todos os anticorpos são adicionados como um coquetel em um único passo para rotular o tecido. A tecnologia UltraPlex usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com hapten seguido de um coquetel de anticorpos secundários anti-hapten conjugados com fluoroforre. A tecnologia InSituPlex8 usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com DNA únicos que são simultaneamente adicionados ao tecido seguido de um passo de amplificação e finalmente sondas conjugadas com fluoroforre que são complementares a cada seqüência de DNA única no anticorpo primário. Ambas as tecnologias permitem a detecção de quatro marcadores mais 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Duas outras abordagens para coloração multiplex simultânea são baseadas na espectrometria de massa de íons secundária9. O Sistema de Imagem Hyperion usa citometria de massa de imagem10 para detectar até 37 marcadores. Esta tecnologia usa um coquetel de anticorpos conjugados em metal para manchar os tecidos, e áreas específicas dos tecidos são ablatadas por um laser e transferidas para um citómetro de massa onde os íons metálicos são detectados. Outra tecnologia semelhante é o IONPath, que usa tecnologia de imagem de feixe de íons multiplexados11. Esta tecnologia usa um instrumento de espectrometria de massa modificado e uma fonte de íons de oxigênio em vez de laser para abpartir os anticorpos conjugados com metal. Embora todas essas abordagens simultâneas de coloração multiplex permitam a detecção de múltiplos marcadores, os custos envolvidos para conjugar DNA, haptens ou metais a anticorpos, a perda de tecido devido à ablação e o processamento extensivo de imagem para desmisturanão não podem ser subestimados. Além disso, kits e protocolos de coloração estão atualmente disponíveis apenas para tecidos FFPE e o desenvolvimento de painéis personalizados implica tempo e gastos adicionais.

O método sequencial de coloração multiplex, em contraste, inclui rotular o tecido com um anticorpo para um marcador, descascando para remover o anticorpo, seguido por repetições seqüenciais deste processo para rotular múltiplos marcadores12. A amplificação do sinal de tyramide (TSA) é o método de multiplexação seqüencial mais utilizado. Duas outras tecnologias de multiplexação usam uma combinação de métodos de coloração simultâneas e seqüenciais. A plataforma CODEX13 emprega um coquetel de anticorpos conjugados a sequências únicas de DNA oligonucleotídeo que são eventualmente rotulados com um fluoróforo usando uma etapa de polimerização indexada seguida de imagem, descascamento e repetição do processo para detectar até 50 marcadores. A abordagem de coloração multiplex MultiOmyx14 é uma iteração de coloração com um coquetel de três a quatro anticorpos conjugados com fluoroformes, imagem, saciação dos fluoróforos, e repetindo este ciclo para detectar até 60 marcadores em uma única seção. Semelhante ao método de coloração multiplex simultâneo, enquanto uma ampla gama de marcadores pode ser detectada, o tempo envolvido na coloração, aquisição de imagens, processamento e análise é extenso. A etapa de descascamento/saciedade envolve aquecimento e/ou branqueamento da amostra de tecido e, portanto, a abordagem sequencial de coloração multiplex é comumente realizada em tecidos FFPE que mantêm a integridade do tecido ao aquecer ou branquear.

A fixação da formalina e a incorporação subseqüente de parafina são prontamente realizadas em um ambiente clínico, blocos de tecido são fáceis de armazenar e vários protocolos de coloração multiplex estão disponíveis. No entanto, o processamento, incorporação e deparafinação dos tecidos de FFPE, bem como a recuperação de antígenos15, um processo pelo qual os anticorpos podem acessar melhor os epítopos, é demorado. Além disso, o processamento envolvido nos tecidos ffpe contribui para a autofluorescência16 e mascara epitopes-alvo, resultando na variabilidade e falta de clone de anticorpos disponíveis para detectar antígenos nos tecidos FFPE17,18,19. Um exemplo é o antígeno leucócito humano (HLA) classe I alelos20. Em contraste, o congelamento instantâneo de tecidos não envolve etapas de processamento extensivas antes ou depois da fixação, contornando a necessidade de recuperação de antígenos21,22, e tornando-o benéfico para a detecção de uma gama mais ampla de alvos. Portanto, o uso de tecidos congelados para imagens de fluorescência multiespectrais pode ser valioso para detectar alvos para estudos pré-clínicos e clínicos.

Dadas as limitações acima mencionadas ao usar tecidos FFPE, perguntamos se a imagem de fluorescência multiespectral pode ser realizada em tecidos congelados. Para responder a essa questão, testamos um método de coloração multiplex simultâneo usando um painel de anticorpos conjugados com fluoroforo para detectar múltiplos antígenos e analisamos a coloração usando um sistema de imagem multiespectral semi-automatizado. Conseguimos simultaneamente manchar até seis marcadores em uma única seção de tecido dentro de 90 minutos.

Protocol

Os tecidos tumorais de camundongos e hlf1623 foram obtidos em nosso laboratório. O tecido de amígdalas humanas foi comprado de um vendedor comercial. Os detalhes estão fornecidos na Tabela de Materiais. 1. Incorporação de tecidos Incorpore tecido fresco na solução OCT (temperatura de corte ideal) e congele o snap usando gelo seco ou nitrogênio líquido. Armazene tecidos a -80 °C. 2. Criosecç?…

Representative Results

Detecção de marcadores manchados únicos em seções congeladas do baçoComo o sistema de imagem semi-automatizado usa um sistema de filtro de cristal líquido (LCTF) que permite uma gama mais ampla de detecção de comprimento de onda25, e como não foram realizadas etapas de amplificação de sinal aqui, primeiro otimizamos a detecção de nossos anticorpos conjugados primários para cada marcador no microscópio. Um exemplo é mostrado na Figura 1,</s…

Discussion

Os tecidos congelados têm sido amplamente utilizados para a imagem mIF para detectar tradicionalmente três a quatro marcadores31 em um tecido usando o método direto e indireto32. No método direto, os anticorpos são conjugados a corantes fluorescativos ou pontos quânticos33 para rotular o tecido, enquanto no método indireto, um anticorpo primário não conjugado é usado para rotular o tecido seguido por um anticorpo secundário conjugado com f…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A orientação de imagem e análise foi fornecida pelo Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core da Universidade de Illinois em Chicago, criado com o apoio do escritório do Vice-Chanceler para Pesquisa. O trabalho foi apoiado pelo NIH/NCI RO1CA191317 ao CLP, pelo NIH/NIAMS (subvenção da SBDRC 1P30AR075049-01) ao Dr. A. Paller, e pelo apoio do Centro De Câncer Integral Robert H. Lurie ao Núcleo de Avaliação de Imunoterapia da Universidade Northwestern.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

Riferimenti

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Ricerca sul cancro. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Play Video

Citazione di questo articolo
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

View Video