JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Published: March 30, 2020
doi:
10.3791/60806
, , ,
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, 2Department of Pathology,University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University

Summary

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Abstract

Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokularda multispektral floresan görüntüleme, tek bir doku örneğinde antijen koekspresyonu ve belirteçlerin mekansal dağılımı hakkında bilgi sağlayabilen birden fazla belirteç saptanmasını sağlar. Ancak, formalin-sabit dokular için uygun antikoreksikliği tespit edilebilir belirteçlerin doğasını kısıtlayabilir. Buna ek olarak, boyama yöntemi zaman alıcıdır. Burada dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapmak için hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem kullanılan florofor kombinasyonları, fare ve insan dondurulmuş dokuların boyama için ayrıntılı adımlar ve tarama, edinim ve analiz prosedürleri içerir. Boyama analizi için, ticari olarak kullanılabilen yarı otomatik multispektral floresan görüntüleme sistemi kullanılır. Bu yöntemle, en fazla altı farklı belirteçler lekeli ve tek bir dondurulmuş doku bölümünde tespit edildi. Makine öğrenme analiz yazılımı kantitatif analiz için kullanılabilecek hücreleri fenotip olabilir. Burada dondurulmuş dokular için açıklanan yöntem FFPE dokularında tespit edilemeyen veya FFPE dokuları için antikor bulunmayan belirteçlerin saptanmasında yararlıdır.

Introduction

Mikroskobik görüntüleme tekniklerindeki son gelişmeler, biyolojik süreçler ve hastalık durumları hakkındaki bilgi mizi ve anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiştir. Kromozomimmünohistokimya (IHC) yoluyla dokularda proteinlerin yerinde tespiti patolojide rutin olarak yapılmaktadır. Ancak, kromojenik IHC boyama kullanarak birden fazla belirteç lerin saptanması1 zorlu ve birden fazla biyolojik belirteçtekbir doku örneğinde etiketlendiği multipleks immünoresans (mIF) boyama yaklaşımları kullanmak için yeni yöntemler geliştirilmektedir. Doku mimarisi, hücrelerin mekansal dağılımı ve antijen ko-ekspresyonu ile ilgili bilgiler tek bir doku örneği2yakalanır, çünkü birden fazla biyolojik belirteçlerin tespiti yararlıdır. Multispektral floresan görüntüleme teknolojisinin kullanımı birden fazla biyolojik belirteç lerin tespitini mümkün kılmıştır. Bu teknolojide, belirli optik kullanarak her bir florofor floresan spektrumları ayrılabilir veya “karışmamış”, herhangi bir spektral crosstalk olmadan birden fazla belirteçlerin algılanmasını sağlayan3. Multispektral floresan görüntüleme hücre biyolojisi, preklinik ilaç gelişimi, klinik patoloji ve tümör immün profilleme4,5,5,6kritik bir yaklaşım haline gelmektedir. Daha da önemlisi, bağışıklık hücrelerinin aralıklı dağılımı (özellikle CD8 T hücreleri) mevcut tümörleri olan hastalar için bir prognostik faktör olarak hizmet verebilir7.

Çokleksi floresan boyama için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve aynı anda veya sırayla yapılabilir. Eşzamanlı boyama yönteminde, tüm antikorlar tek bir adımda bir kokteyl olarak doku etiketlemek için bir araya eklenir. UltraPlex teknolojisi hapten konjuge birincil antikorlar bir kokteyl ve florofor konjuge anti-hapten ikincil antikorlar bir kokteyl kullanır. InSituPlex teknolojisi8 aynı anda bir amplifikasyon adım ve son olarak birincil antikor her benzersiz DNA dizisi tamamlayıcı florofor konjuge problar takip doku eklenir benzersiz DNA konjuge birincil antikorlar bir kokteyl kullanır. Bu teknolojilerin her ikisi de nükleer boyama için dört belirteç artı 4′,6-diamino-2-fenilindole (DAPI) tespitisağlar. Eşzamanlı multipleks boyama için diğer iki yaklaşım ikincil iyon kütle spektrometresi dayanmaktadır9. Hyperion Görüntüleme Sistemi 37 belirteçleri tespit etmek için görüntüleme kitle sitometri10 kullanır. Bu teknoloji dokuları lekelemek için metal konjuge antikorlar bir kokteyl kullanır, ve dokuların belirli alanlarda bir lazer tarafından ablated ve metal iyonları tespit edilen bir kitle sitometre aktarılır. Başka bir benzer teknoloji IONPath, hangi multiplexed iyon ışını görüntüleme teknolojisi11kullanır. Bu teknoloji, metal konjuge antikorları ablate lazer yerine değiştirilmiş bir kütle spektrometresi alet ve oksijen iyon kaynağı kullanır. Tüm bu eşzamanlı multipleks boyama yaklaşımları birden fazla belirteçlerin saptanmasını sağlarken, DNA, haptens veya metallerin antikorlara konjugasyonu için yapılan maliyetler, ablasyon nedeniyle doku kaybı ve karıştırmayı ortadan çıkarmak için kapsamlı görüntü işleme hafife alınamaz. Ayrıca, kitleri ve boyama protokolleri şu anda sadece FFPE dokular için kullanılabilir ve özel paneller geliştirmek ek zaman ve harcama gerektirir.

Sıralı multipleks boyama yöntemi, aksine, bir işaretleyici bir antikor ile doku etiketleme içerir, antikor kaldırmak için sıyırma, birden fazla işaretleri etiketlemek için bu sürecin ardışık tekrarları takip12. Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) en sık kullanılan ardışık çoklama yöntemidir. Diğer iki çoklama teknolojisi, eşzamanlı ve sıralı boyama yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanır. CODEX platformu13, 50’ye kadar belirteç tespit etmek için süreci görüntüleme, sıyırma ve yineleme nin ardından indeksli polimerizasyon adımı kullanılarak florofor ile etiketlenen benzersiz DNA oligonükleotid dizilerine konjuge antikorlardan oluşan bir kokteyl kullanır. MultiOmyx multiplex boyama yaklaşımı14 üç ila dört florofor konjuge antikorlar bir kokteyl ile boyama bir yineleme, görüntüleme, floroforlar söndürme, ve tek bir bölümde 60 belirteçleri kadar tespit etmek için bu döngünüks. Eşzamanlı multipleks boyama yöntemine benzer şekilde, çok çeşitli belirteçler tespit edilebilirken, boyama, görüntü edinme, işleme ve analiz de dahil olmak üzere zaman geniştir. Sıyırma/söndürme adımı, doku örneğinin ısıtılması ve/veya beyazlatma işlemini içerir ve böylece, sıralı multipleks boyama yaklaşımı genellikle ısıtma veya ağartma üzerine doku bütünlüğünü koruyan FFPE dokularda gerçekleştirilir.

Formalin fiksasyonu ve sonraki parafin katıştırma klinik ortamda kolayca yapılır, doku blokları nın saklanması kolaydır ve birkaç multipleks boyama protokolü mevcuttur. Ancak, işleme, katıştırma ve FFPE dokuların deparafinizasyon, yanı sıra antijen alma15, antikorlar daha iyi epitoplar erişebilirsiniz hangi bir süreç, zaman alıcıdır. Ayrıca, FFPE dokularında yer alan işleme otofloresans katkıda16 ve maskeler hedef epitoplar, değişkenlik ve FFPE dokularda antijenleri tespit etmek için mevcut antikor klon eksikliği ile sonuçlanan17,18,19. Bir örnek insan lökosit antijeni (HLA) sınıf I alel20olduğunu. Buna karşılık, dokuların hızlı dondurma önce veya sabitleme sonra kapsamlı işleme adımları içermez, antijen alma ihtiyacını atlatmak21,22, ve hedeflerin daha geniş bir yelpazede tespit etmek için yararlı hale. Bu nedenle, multispektral floresan görüntüleme için dondurulmuş dokuların kullanılması preklinik ve klinik çalışmalar için hedefleri tespit etmek için değerli olabilir.

FFPE dokuları kullanırken yukarıda belirtilen sınırlamalar göz önüne alındığında, dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapılıp yapılamayacağını sorduk. Bu soruyu çözmek için, birden fazla antijeni tespit etmek için florofor konjuge antikorlardan oluşan bir panel kullanarak eşzamanlı çok katlı boyama yöntemini test ettik ve yarı otomatik multispektral görüntüleme sistemi kullanarak boyama analiz ettik. Aynı anda 90 dakika içinde tek bir doku bölümünde altı belirteçleri kadar leke başardık.

Protocol

Laboratuarımızdan fare dalak ve HLF16 fare tümör dokuları23 elde edildi. İnsan bademcik dokusu ticari bir satıcıdan satın alındı. Ayrıntılar Malzeme Tablosu’ndaverilmiştir. 1. Doku Katıştırma Taze dokuyu OCT (optimum kesme sıcaklığı) çözeltisi ve kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak ani donma yerleştirin. Dokuları -80 °C’de saklayın. 2. Kriyoding -25 °C sıca…

Representative Results

Dondurulmuş dalak kesitlerinde tek lekeli belirteçlerin tespitiYarı otomatik görüntüleme sistemi, daha geniş bir dalga boyu algılama25aralığına olanak tanıyan sıvı kristal konserve filtre (LCTF) sistemi kullandığından ve burada sinyal amplifikasyon adımları yapılmadığından, ilk olarak mikroskoptaki her bir belirteç için birincil çekimli antikorlarımızın tespitini optimize ettik. Bir örnek Şekil 1’degösterilmiştir ,…

Discussion

Dondurulmuş dokular yaygın geleneksel doğrudan ve dolaylı yöntem32kullanarak bir doku üzerinde üç ila dört belirteçleri31 tespit etmek için mIF görüntüleme için kullanılmıştır. Doğrudan yöntemde, antikorlar floresan boyalar veya kuantum nokta33 doku etiketlemek için konjuge edilir, dolaylı yöntemde ise, konjuge olmayan bir birincil antikor özellikle birincil antikor tanıyan bir florofor-konjuge ikincil antikor takip doku eti…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Görüntüleme ve analiz rehberliği, Chicago’daki Illinois Üniversitesi’nde Araştırma Kaynakları Merkezi – Araştırma Histolojisi ve Doku Görüntüleme Çekirdeği tarafından, Araştırma dan sorumlu Rektör Yardımcısı’nın desteğiyle kurulmuştur. Çalışma NIH / NCI RO1CA191317 clp, NIH / NIAMS (SBDRC hibe 1P30AR075049-01) Dr A. Paller ve Robert H. Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi desteği ile Northwestern Üniversitesi’nde İmmünoterapi Değerlendirme Çekirdek desteklendi.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Ricerca sul cancro. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingBiomarker DetectionCo-localizationRapid Staining MethodSpectral LibraryMachine LearningImage Analysis
check_url/it/60806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image