Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler som skulle göra det möjligt för användaren att utvärdera läkemedelsinducerad störd eIF4F-komplex dynamik i screeningformat.
Abstract
Bildandet av eIF4F-komplexet har visat sig vara den viktigaste nedströmsnoden för konvergens av signalvägar som ofta genomgår onkogen aktivering hos människor. eIF4F är ett kap-bindande komplex som är involverat i mRNA-ribosome rekryteringsfasen av översättningsinitiering. I många cellulära och prekliniska modeller av cancer leder avregleringen av eIF4F till ökad översättning av specifika mRNA-undergrupper som är involverade i cancerspridning och överlevnad. eIF4F är ett hetero-trimeriskt komplex byggt av den kapbindande underenheten eIF4E, helicase eIF4A och byggnadsställningsunderenheten eIF4G. Avgörande för montering av aktiva eIF4F-komplex är protein-proteininteraktionen mellan eIF4E- och eIF4G-proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att mäta eIF4F-sammansättning som övervakar statusen för eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler. EIF4e:4G cellbaserad protein-protein interaktionsanalys gör det också möjligt att noggrant och tillförlitligt bedöma läkemedelsinducerade förändringar i eIF4F komplexa integritet. Vi föreställer oss att denna metod kan tillämpas för att verifiera aktiviteten hos kommersiellt tillgängliga föreningar eller för ytterligare screening av nya föreningar eller modaliteter som effektivt stör bildandet av eIF4F-komplex.
Introduction
Kontroll av genuttryck spelar en central roll i korrekt utförande av cellulära program såsom tillväxt spridning och differentiering. En reglerande kontrollmekanism kan utövas antingen på genkriberingsnivå eller på nivån för mRNA-översättning. Under det senaste decenniet har det blivit alltmer uppenbart att translationell kontroll genom modulering av initieringsprocessen snarare än de senare stegen av förlängning och avslutning fint kan reglera syntesen av specifika delmängder av proteiner som spelar ett brett spektrum av biologiska funktioner.
Ökad översättning av mRNAs som är involverade i överlevnad, anti-autophagic och anti-apoptotic svar har varit inblandade i flera cancerformer och har också varit kausativt kopplade till antingen avvikande aktivering eller över uttryck för översättning inledandefaktorer 1.
EIF4F-komplexet är en huvudregulator för översättningsinitiering. Genom att binda kap-strukturen i 5' änden av mRNAs, eIF4F driver inledande mRNA-ribosom rekrytering och i sin tur öka mRNA översättning effektivitet av svagt översatta eukaryotic mRNAs2. eIF4F-förmedlad översättning av cancerrelaterade mRNAs har rapporterats för många cancermodeller som hyser avvikande aktivering av RAS/ MAPK eller AKT / TOR-vägar, vilket tyder på att cancerceller uppreglerar eIF4F för att öka sin egen pro-neoplastiska aktivitet. Störning av denna feed-forward loop genom att hämma eIF4F komplexa bildandet är därmed en mycket lovande terapeutisk strategi3,4.
EIF4F-komplexet består av i) eIF4E, Den kapbindande underenheten i eIF4F som interagerar med den takstruktur som finns vid mRNA:s 5' UTR, ii) eIF4A, RNA-helicase och iii) eIF4G, ställningsproteinet som interagerar med både eIF4A och eIF4E och som så småningom rekryterar 40S ribosomalunderenhet5. eIF4G-associering med eIF4E är det hastighetsbegränsande steget för montering av funktionella eIF4F-komplex och det regleras negativt av eIF4E-bindande proteiner (4EBPs, medlemmar 1, 2 och 3))6. Genom att konkurrera med eIF4G-bindning till eIF4E genom ett gränssnitt som består av kanoniska och icke-kanoniska eIF4E-bindningssekvenser7,8,9 (region som sträcker sig över aa 604-646 på human eIF4E), minskar 4EBP poolen av eIF4E som aktivt deltar i översättning och förhindrar eIF4F-komplexbildning. Samspelet mellan dessa proteinproteininteraktioner regleras huvudsakligen av däggdjursmålet rapamycin (mTOR)-medierad fosforylering av 4EBP. Vid mitogena stimuli fosforylerar mTOR direkt medlemmarna i proteinfamiljen 4E-BP, minskar deras koppling till eIF4E och därigenom främjar eIF4E-eIF4G-interaktion och bildandet av funktionella eIF4F-komplex10.
Trots den stora ansträngningen att utveckla föreningar riktade mot eIF4F komplexa integritet, bristen på analyser som mäter direkta störningar av eIF4E-eIF4G interaktion i levande celler har begränsat sökandet efter cellulära aktiva hit föreningar. Vi har tillämpat en luciferasanalys baserad på en coelenterazinanalog (t.ex. Nanoluc-baserad komplementeringsanalys) för att i realtid övervaka statusen för eIF4F-integritet genom eIF4E-eIF4G-interaktionen. Luciferase komplementering protein systemet består av en 18 kDa protein fragment (SubA) och 11 aminosyra peptid fragment (SubB) optimeras för minimal självanslutning och stabilitet11. En gång uttryckt som en fusionsprodukt med den mänskliga fulllängds eIF4E och eIF4E-interaktionsdomänen från human eiF4G1 (aa 604-646) kommer de två interagerande proteinerna att föra SubA- och SubB-fragmentet i närheten av varandra och kommer att inducera bildandet av den aktiva luciferasen som, i närvaro av ett cellpermeabelt substrat, så småningom kommer att generera en ljus luminescent signal (figur 1). Vi har på annat håll rapporterat om konstruktion och validering av eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Här beskriver vi hur eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem (tillgängligt på begäran) kan tillämpas för att korrekt mäta 4EBP1-medierad eIF4E-eIF4G-störning i levande celler. Dessutom visar vi dess nytta genom att mäta effekterna av flera mTOR-hämmare som för närvarande är under kliniska prövningar som potentiella cancerterapeutiska läkemedel12. Eftersom effekter utanför målet ofta maskerar läkemedelsspecifik aktivitet beskriver vi också hur mångsidigheten hos systemmätningen eIF4E:eIF4G604-646 kan utökas med ortogonala mätningar av cellulär livskraft för att ta hänsyn till dessa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HEK293 cellinje användes för protokollet och odlades i Dulbeccos modifierade eagle medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum, 2 mM L-glutamin och 100 U/mL penicillin/streptomycin. Cellerna odlades vid 37 °C med 5% CO2 i en fuktad miljö.
1. Kvantitativ bedömning av eIF4F-komplexa störningar via eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalys
- Cellkultur och övergående transfektion av eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalys
- Använd ny tinade celler med mindre än 20 passager för alla experiment. På dag 1 bestämmer du cellnumret med hjälp av en standardcellräknare och räknar de totala livskraftiga cellerna med trypan blue exclusion method13.
- Frö 6-brunnsplattor med 0,9 - 1,2 x 106 HEK 293 celler per brunn i 2 ml standardtillväxtmedium.
OBS: För att uppnå bästa transfektionseffektivitet inom de cellinjer som anges ovan, se till att de pläterade cellerna är 70-90% konfluenta dagen efter sådd. - På morgonen dag 2, co-transfect celler med SubA-eIF4E och eIF4G604-646-SubB plasmid med hjälp av en lipid-baserade transfection reagens (se Tabell över material)som beskrivs nedan.
- Späd 9 μL liposombaserad lösning i ett rör som innehåller 125 μL reducerat serummedium utan fenolrött (se materialförteckning)för varje transfection och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Förbered masterblandning av DNA genom att späda ut 3 μg av varje plasmid i 125 μL reducerat serummedium för varje transfektionsrör.
- Tillsätt 12 μL förstärkarreagenser i DNA-masterblandningsröret, blanda väl och tillsätt omedelbart DNA: förstärkare master mix till varje rör av utspädda liposomer i ett förhållande 1:1. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt DNA-lipidkomplexet till varje brunn och inkubera cellerna i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i 24 timmar.
- På morgonen på dag 3, skölj varje brunn med 1 ml PBS.
- Ta bort PBS och inkubera celler i varje brunn med 0,3 ml trypsin i 5 min vid 37 °C.
- Neutralisera trypsin genom att tillsätta 2 ml reducerat serummedium utan fenolrött som innehåller 0% FCS i varje brunn och överföra transfekterade celler till ett 15 ml-rör.
OBS: Fenolrött kan störa luciferasaktiviteten; Därför måste celler hanteras från detta steg och framåt i medium utan fenolrött. - Snurra ner celler i 5 min vid 290 x g och aspirera mediet. Återanvänd cellerna i 2 ml av det reducerade serummediet utan fenolrött innehållande 0% FCS. Räkna enligt beskrivningen i steg 1.1.
- Frötransfekterade HEK 293 celler i 96 väl ogenomskinliga plattor med en densitet av 30 000 celler per brunn i 90 μL medium utan fenolrött innehållande 0% FCS. För att erhålla 3 tekniska replikat inom samma experiment för 3 olika föreningar, frö 60 brunnar av plattorna med celler exklusive brunnarna på kanterna.
- Omedelbart efter sådd av de transfekterade cellerna, tillsätt 10 μL 10% DMSO-sammansatt lösning (se steg 1. 2).
- Sammansatt beredning
- Förbered 1 mM sammansatta stamlösningar genom att lösa upp intressemassan i 100% DMSO (v/v). För att få 3 replikat för varje sammansatt titrering, använd 8 μL av 1 mM sammansatt stamlösning.
OBS: Volymen av 1 mM lagerförening som används är mer än vad den behövs. Detta görs för att ta hänsyn till eventuella pipettingfel. - Utför en 2-faldig seriell utspädning av stamblandningslösningen med 4 μL av 1 mM-beståndet i 4 μL 100% DMSO för varje titreringspunkt.
OBS: För en fullständig sammansatt titrering, utför 9 seriella utspädningar från startstocken i 100% DMSO. Om flera föreningar behöver testas, använd en 96 brunnsplatta och en flerkanalspipett för att underlätta detta steg och efterföljande utspädningar. - Tillsätt 36 μL sterilt vatten av HPLC-klass för varje punkt i den tvåfaldiga seriespädningen för att förbereda en 40 μL 10x arbetslösningar i 10 % DMSO (v/v) (dvs. 100 μM till 0,39 μM 10% DMSO lagerserie kommer att leda till en slutlig lösning på 10 μM till 0,039 μM,i 1% DMSO när den läggs till celler). När det gäller behandlingskontroll, förbered också en 10% DMSO endast lagerlösning i HPLC-klass sterilt vatten.
- Tillsätt 10 μL 10x arbetslösningar till cellerna i den 96 väl ogenomskinliga plattan för att ge den avsedda slutliga koncentrationen med en rest DMSO-koncentration på 1% (v/v) i en total volym på 100 μL och inkubera i 3 timmar vid 37 °C med 5 % v/v atmosfärisk CO2.
- Förbered 1 mM sammansatta stamlösningar genom att lösa upp intressemassan i 100% DMSO (v/v). För att få 3 replikat för varje sammansatt titrering, använd 8 μL av 1 mM sammansatt stamlösning.
- Luciferase komplementering och lönsamhetsanalys
- Efter 3 h läkemedelsbehandling, börja förbereda luciferassubstratreagenset genom att kombinera 1 volym substrat med 19 volymer av utspädningsreagenset (se tillverkarens instruktioner).
OBS: Luciferase-analysen utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (se Materialförteckning ). - Använd en flerkanalspipett för att omedelbart tillsätta 25 μL substratreagens.
- Skaka plattan vid 350 varv/min i 50 minuter på en orbital shaker vid rumstemperatur.
- Utvärdera ljusstyrkan med hjälp av en plåtläsare. För att göra det, ställ spegelläsaren på luminescence och emissionsfiltret på 455. Använd en mäthöjd på 6,5 mm med en mättid på 1 s.
- För att öka cellens livskraft, tillsätt 33 μL lönsamhetsreagens och mät sedan luminescence igen efter 15 min vid rumstemperatur med hjälp av plattläsaren.
- Bedöm luminescence med plåtläsaren genom att ställa spegelläsaren på Luminescence och emissionsfiltret på 600 nm. Använd en mäthöjd på 6,5 mm med en mättid på 1 s.
OBS: Livskraften bedöms genom att mäta atp-intracellulär nivå på celllys enligt tillverkarens anvisningar. Multiplexering är möjlig i detta fall eftersom livskraftsanalysen använder en annan luciferas med en annan emissionsvåglängd. - Använd data för att bestämma IC50-värdena för varje förening genom kurva som passar data till en ekvation med 4 parameterpassningskurva:
Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D
De numeriska värdena D och A måste begränsas i kurvmonteringsprocessen:
D = luminescent värde på Y-axeln för minimal kurvasymmetri eller minimal teoretisk svarsnivå som förväntas från eIF4E:4G-komplementeringstestet.
A = luminescent värde på Y-axeln för maximal kurvasymmetri eller maximal teoretisk nivårespons som förväntas från eIF4E:4G komplementeringsanalys.
OBS: Värdet för det minimala svaret härleds från 1% DMSO (v/v) kontrollbehandling och värdet för det maximala svaret härleds från det maximala svaret från en hög affinitetsmTOR-hämmare som har platå utan effekt på cellens livskraft.
- Efter 3 h läkemedelsbehandling, börja förbereda luciferassubstratreagenset genom att kombinera 1 volym substrat med 19 volymer av utspädningsreagenset (se tillverkarens instruktioner).
2. Korrelerande eIF4E:eIF4G604-646 analyshämning med eIF4F komplexa störningar i celler
- För att bekräfta att signalen som mäts med analysen motsvarar den fysiska störningen av eIF4E-eIF4G-interaktionen med föreningen, såddceller enligt beskrivningen i steg 1.1.
- Dagen efter, ersätt mediet med 1 ml reducerat serummedium som inte innehåller fenolrött och inkubera i 4 timmar med intresseföreningen. Säkerställ kvarvarande DMSO-koncentration på 1% (v/v) i en total volym på 1 ml.
OBS: För att enkelt möjliggöra en korrelation med resultatet, använd sammansatta koncentrationer i början, mittpunkten och slutpunkten för den uppmätta komplementeringsanalystitreringskurvan. - Lyse celler och utförd m7GTP dra ner för att isolera eIF4F och eIF4E:4EBP1 komplex. Detaljerade procedurer för hur man utför m7GTP pull down experiment finns någon annanstans14.
- Detekteram 7 GTP-bundna eIF4G-, eIF4E- och 4EBP1-proteinnivåer genom western blot-analys och korrelera sedan med eIF4F-komplexa störningar med komplementeringstestsignalhämning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera känsligheten hos eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem bedömdes 4EBP1-medierad hämning av eIF4F-komplex montering med hjälp av mTOR-hämmare. Genom att hämma mTORC1-kinasberoende fosforylering av 4EBP-proteinfamiljen förstärker mTOR-hämningen 4EBP1-associationen till eIF4E och därmed eIF4F demontering15. Två klasser av mekanistiskt olika hämmare av mTOR-kinaser testades: rapaloger (t.ex. Rapamycin) som är allosteriska hämmare av mTORC1 men inte mTORC2- och ATP-konkurrenskraftiga hämmare (t.ex. PP242) som är utformade för att specifikt hämma både mTORC1 och mTORC2 kinas katalytisk aktivitet.
HEK293 celler transfected med eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem som beskrivs i steg 1. Efter 24 h transfection såddes celler igen och behandlades med mTOR-hämmarna PP242 och rapamycin (enligt beskrivningen i steg 1. 2). Fyra timmar efter behandlingen bedömdes luminescence, som beskrivits tidigare, följt av cellens livskraft. Som visas i figur 2ger PP242 en dosberoende hämning av signalen med en beräknad IC50 på 0,72 ± 0,04 μM, medan en IC50 på 6,88 ± 0,88 μM härleds för rapamycin (figur 2A). Plattorna multiplexerades sedan för cellulär livsduglighetsanalys(figur 2D). Denna analys visar att varken PP242 eller rapamycin ger en signifikant minskning av cellens livskraft, vilket bevisar att minskningen av luminescence i eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem inte beror på ospecificerad celldöd utan snarare genom störningar i eIF4E:4G-interaktionen.
Ett m7GTP-pull down-experiment som utförs genom att inkubera opåverkade celler med sammansatta koncentrationer som motsvarar början, mitten och slutpunkterna i den uppmätta titreringskurvan i figur 2A visar att 4EBP1-medierad störning av endogen eIF4E-eIF4G-interaktion korrelerar med den uppmätta eIF4E:eIF4G604-646-analyssignalen (figur 2B, 2C). I överensstämmelse med dessa resultat har PP242 visat sig vara en mer potent hämmare av totalt 4EBP1 fosforylering än rapamycin under de experimentella förhållanden som testats i HEK 293 celler (figur 3A), medan båda hämmarna visade en inverkan på mTOR signalering normalt, med rapamycin som är mer aktiv mot mTORC1-substrat och PP242 riktade mot både mTORC1 och mTORC2 (Figur 3B).
Sammantaget visade dessa resultat att PP242 är effektivare när det gäller att störa eIF4F-komplexbildning än rapamycin i HEK293-celler och ytterligare visa att eIF4E:eIF4G604-646-systemet noggrant kan mäta eIF4F-komplex montering i levande celler.
Diagram 1: eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem. Schematisk representation som visar hur interaktionen mellan protein X (eIF4E) och protein Y (eIF4G604-646) gör det möjligt för SubA- och SubB-fusioner att komma i närheten av varandra och rekonstruera den aktiva luciferasen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: 4EBP1-medierad störning av eIF4F-komplexet. a)PP242 och rapamycin eIF4E:eIF4G604-646-analystitrering som modellerar samspelet mellan eIF4E och eIF4G i transfekterade HEK 293-celler. B,C) Western blot analys som visar endogen nivå av eIF4E, eIF4G och 4EBP1 i HEK 293 extrakt och i m7GTP dra ner efter inkubation av odlade celler med olika koncentration av PP242 eller Rapamycin respektive. D)Behandlade celler i A där multiplexerade för cellens livskraft och luminescence bedömdes. Alla värden representerar medelvärdet ± SD (n=3). Denna siffra har ändrats från16. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Differentiell effekt av mTOR-hämning på 4EBP1-phoshorylation. a)Västerländsk blotanalys av fosforyleringsstatus på 4EBP1 i icke-transfecterade HEK293-celler som behandlats med indicerad koncentration av PP242 och rapamycin. B)Western blot-analys av AKT- och S6-fosforyleringsstatus i icke-transfecterade HEK293-celler som behandlats med antingen de dubbla MTORC1/2 aktiva platshämmarna PP242, eller den allosteriska hämmaren av mTORC1 Rapamycin. Beta aktin visualiserades för laddningskontroll samt totalt 4EBP1, AKT och S6. Denna siffra har ändrats från16. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs i denna artikel använder en luciferase-baserad komplementeringsanalys för att kvantitativt övervaka eIF4F-komplex montering genom direkt mätning av eIF4G-eIF4E-interaktion i levande celler. Vi har lämnat detaljer för användning av eIF4E-eIF4G komplementeringssystem och vi har också visat att systemet är extremt exakt vid mätning av läkemedelsinducerad 4EBP1-medierad dissociation av eIF4E-eIF4G interaktion16. För att underlätta genomströmningen av denna analys har den experimentella installationen som beskrivs i den här artikeln utformats för en 96-brunns mikroplatta format användning.
För optimala resultat bör två kritiska steg övervägas vid utförandet av analysen. För det första bör transfectioneffektiviteten mellan experiment förbli liknande. Detta kan säkerställas genom användning av celler med lågt passagenummer och genom att noggrant räkna celler på sådddagen. Cellkonfluens bör också bedömas innan DNA-transfektion utförs, eftersom det inte rekommenderas att överföra celler med lipidbaserat transfektionsreagens om cellkonfluensen är mindre än 70-90%. För det andra är det viktigt att multiplexa komplementeringstestet med en cellviabilitetsanalys. Vissa föreningar kan påverka luciferassignalen främst genom att minska antalet livskraftiga celler genom skadliga effekter. Det är därför viktigt att mäta cellens livskraft omedelbart efter eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalys för att hantera icke-måleffekter och icke-specifika effekter.
Proteinproteingränssnitt, sådana som eIF4E och eIF4G, som saknar hydrofobiska klyftor och är relativt stora och plana, anses i allmänhet vara "oläsliga" av konventionella småmolekylterapier (<500 MW)17. Således finns det ett växande intresse för utveckling av nya modaliteter som effektivt interagerar med denna typ av ytor (t.ex. makrocykliska och peptidomimetiska föreningar). Många av dessa nya modaliteter kan dock inte medfödda korsa cellmembranet och engagera sitt mål. För att kringgå dessa frågor bedriver många forskargrupper forskning om nya kemiska optimerings- och cellulära leveransstrategier. Vi föreställer oss att eIF4E:eIF4G604-646 live cell PPI-analys och andra liknande PPI-härledda analyser kommer att spela en avgörande roll för att främja dessa strategier och validera dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av kärnbudgeten från p53lab (BMSI, A *STAR) och JCO VIP-bidraget (A *STAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
References
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J.
- Gebauer, F., Hentze, M. W.
- Bhat, M., et al.
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C.
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al.
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
