从体外感觉和运动神经中纯化成纤维细胞和施万细胞
Summary
在这里，我们提出了一种方法，从体外感觉和运动神经中纯化成纤维细胞和Schwann细胞。
Abstract
周围神经系统的主要细胞是施万细胞（SCs）和成纤维细胞。这两个细胞都清楚地表达在神经营养因子基因表达和其他生物过程的不同模式中涉及的感官和运动表型，影响神经再生。本研究已建立一种方案，以更快获得高度纯化的老鼠感官和运动SCS和成纤维细胞。新生儿大鼠的腹根（运动神经）和后根（感觉神经）分离，细胞培养4-5天，随后通过组合差分消化和差分粘附方法分离感觉和运动成纤维细胞和SC。免疫细胞化学和流式细胞学分析结果表明，感觉和运动SCs和成纤维细胞的纯度为>90%。该协议可用于获得大量的感官和运动成纤维细胞/SCs更快，有助于探索感官和运动神经再生。
Introduction
在外周神经系统中，神经纤维主要由轴子、施万细胞（SCs）和成纤维细胞组成，还含有少量的巨噬细胞、微血管内皮细胞和免疫细胞1。SCs 以 1：1 的比例包裹轴子，并由称为内结组织层的连接组织层封闭。轴子然后捆绑在一起形成称为分柱的组，每个分膜被包裹在称为”内皮”的结缔组织层中。最后，整个神经纤维被包裹在一层结缔组织中，称为肾上腺素。在末体中，整个细胞群体由48%的SC组成，其余细胞中相当一部分涉及成纤维细胞2。此外，成纤维细胞是所有神经隔间的重要组成部分，包括肾上腺素、内膜和内膜3。许多研究表明，在外周神经损伤4、5、6之后，SCs和成纤维细胞4在再生过程中起着至关重要的作用。外周神经转切后，周利尿成纤维细胞通过SCs和成纤维细胞之间的ephrin-B/EphB2信号通路调节细胞分选，进一步引导弓弦再生通过伤口5。外周神经成纤维细胞分泌泰纳辛-C蛋白，并通过+1-integrin信号通路7增强SCs在神经再生期间的迁移。然而，上述研究中使用的SCs和成纤维细胞来自坐骨神经，包括感觉神经和运动神经。
在外周神经系统中，感觉神经（发热神经）从受体到中枢神经系统（CNS）进行感官信号，而运动神经（发热神经）则从CNS传导到肌肉的信号。先前的研究表明，SCs表达不同的运动和感官表型和分泌神经营养因子，以支持周围神经再生,8，9。根据最近的一项研究，成纤维细胞也表达不同的运动和感官表型，并影响SC10的迁移。因此，探索运动和感觉神经成纤维细胞/SCs之间的差异使我们能够研究周围神经特异性再生的复杂底层分子机制。
目前，有许多方法可以净化SCs和成纤维细胞，包括应用抗米氏剂、抗体中联细胞分析11、12、,12顺序免疫平移13和层压基14。然而，上述所有方法都去除成纤维细胞，只保留SCs。高度纯化的SC和成纤维细胞可以通过流式细胞分理技术获得，但它是一种耗时且昂贵的技术。因此，在这项研究中，开发了一种简单的差分消化和差分粘附方法，用于净化和隔离感觉和运动神经成纤维细胞和SC，以便更快获得大量的成纤维细胞和SC。
Protocol
Representative Results
Discussion
周围神经的两个主要细胞群包括SC和成纤维细胞。主要培养的成纤维细胞和SC可以准确地帮助在外周神经发育和再生期间对成纤维细胞和SC的生理学进行建模。研究表明，P7大鼠坐骨神经细胞含有约85%的S100阳性SCs，13%的OX7阳性成纤维细胞和只有1.5%的OX42阳性巨噬细胞13。虽然成纤维细胞的数量小于SCs，但成纤维细胞的初始增殖率比SCs快。因此，Ara-C是许多研究中最常用的抗米蒂剂，?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了中国国家重点研究发展计划（赠款2017YFA0104703），中国国家自然基金会（赠款号31500927）的支持。
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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