체외에서 감각 및 모터 신경에서 섬유 아세포와 슈완 세포의 정화
Summary
여기서는 체외에서 감각 및 운동 신경에서 섬유아세포와 슈완 세포를 정화하는 방법을 제시합니다.
Abstract
말초 신경계의 주요 세포는 슈완 세포 (SCs) 및 섬유 아세포입니다. 이 세포 는 신경 성 위축인 유전자 발현 및 기타 생물학적 과정의 다른 패턴에 관여하는 감각 및 운동 표현형을 뚜렷하게 표현하여 신경 재생에 영향을 미칩니다. 본 연구는 고도로 정제된 쥐 감각및 운동 SCs 및 섬유아세포를 더 빠르게 얻기 위한 프로토콜을 설치했습니다. 신생아 쥐(7일)의 복부 근루(motor nerve)와 등쪽 뿌리(감각신경)는 4-5일 동안 배양되었고, 이어서 감각및 운동 섬유아세포 및 SC의 분리를 순차적으로 결합하였다. 면역 세포화학 및 유동 세포측정 분석 의 결과는 감각및 운동 SCs 및 섬유아세포의 순도가 >90%였다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 많은 수의 감각 및 운동 섬유아세포/SC를 더 빠르게 획득하는 데 사용될 수 있으며, 이는 감각 및 운동 신경 재생의 탐사에 기여합니다.
Introduction
말초 신경계에서, 신경 섬유는 주로 축축산, 슈완 세포 (SC) 및 섬유 아세포로 구성되며, 또한 소량의 대식세포, 미세 혈관 내피 세포 및 면역 세포1을포함합니다. SC는 축축을 1:1 비율로 감싸고 엔도뉴리움이라고 하는 결합 조직 층에 의해 동봉됩니다. 축삭은 매심이라고 불리는 단을 형성하기 위하여 그 때 함께 묶이고, 각 근막은 회음관으로 알려져 있는 결합 조직 층으로 싸여 있습니다. 마지막으로, 전체 신경 섬유는 에피뇌란이라고 불리는 결합 조직의 층으로 싸여 있습니다. 엔도뉴리움에서, 전체 세포 인구는 48% SC로 이루어져 있고, 나머지 세포의 상당 부분은 섬유아세포2를포함한다. 더욱이, 섬유아세포는 에피뇌리움, 회음관 및 엔도뉴리움3을포함한 모든 신경 구획의 중요한 구성 요소입니다. 많은 연구는 SC와 섬유 아세포가 말초 신경 부상후재생 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 지적했다4,5,,6. 말초 신경의 편부 후, 천동맥 섬유아세포는 SC와 섬유아세포 사이의 에클레인-B/EphB2 신호 전달 경로를 통해 세포 분류를 조절하여 상처5를통해 축축재를 더욱 안내한다. 말초 신경 섬유아세포는 테나신-C 단백질을 분비하고 β1-integrin 신호 전달 경로를 통해 신경 재생 중 SC의 이동을향상시킨다 7. 그러나, 위의 연구에서 사용된 SCs및 섬유아세포는 감각과 운동 신경을 모두 포함하는 상골 신경에서 파생되었습니다.
말초 신경계에서 감각 신경(afferent neuros)은 수용체에서 중추 신경계(CNS)까지 감각 신호를 실시하며, 모터 신경(efferent nerves)은 CNS에서 근육으로 신호를 전한다. 이전 연구는 SC가 뚜렷한 모터 및 감각 표현형을 표현하고 말초 신경재생을지원하기 위하여 신경 영양인을 분비한다는 것을8,9를표시했습니다. 최근 연구에 따르면, 섬유아세포는 또한 다른 모터와 감각 표현형을 표현하고 SC10의이동에 영향을 미친다. 따라서, 모터와 감각 신경 섬유아세포/SC 간의 차이의 탐구는 말초 신경 특정 재생의 복잡한 근본적인 분자 메커니즘을 연구할 수 있게 해줍니다.
현재, 항체 매개 세포분석11,,12,순차면역파닝13 및 라미닌 서브스트라툼(14)의 적용을 포함하여 SC 및 섬유아세포를 정화하는 여러 가지 방법이 있다.14 그러나, 위의 모든 방법은 섬유아세포를 제거하고 SC만 보존합니다. 고도로 정제된 SC 및 섬유아세포는 유동 세포측정 선별기술(15)에의해 얻어질 수 있지만, 시간이 많이 소요되고 비용이 많이 드는 기술이다. 따라서, 본 연구에서는, 많은 수의 섬유아세포와 SC를 더 빠르게 얻기 위해 감각과 운동 신경 섬유아세포 및 SC를 정화및 분리하기 위한 간단한 차동 소화 및 차분 준수 방법이 개발되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
말초 신경의 2개의 중요한 세포 인구는 SCs와 섬유아세포를 포함했습니다. 주로 배양 된 섬유 아세포 및 SC는 말초 신경 발달 및 재생 중에 섬유 아세포 및 SC의 생리학모델링을 정확하게 지원할 수 있습니다. 연구 결과는 P7 쥐 sciatic 신경 세포가 S100 양성 SCs의 대략 85%, OX7 양성 섬유세포의 13% 및 OX42 양성 대식세포의 단지 1.5%를 포함하는 것을 보여주었습니다13. 섬유아세포의 수는 S…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 (그랜트 번호 2017YFA0104703), 중국의 국립 자연 재단 (보조금 번호 31500927)에 의해 지원되었다.
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
Riferimenti
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
