Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro
Summary
Hier präsentieren wir eine Methode zur Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in vitro.
Abstract
Die Hauptzellen im peripheren Nervensystem sind die Schwann-Zellen (SCs) und die Fibroblasten. Beide Zellen drücken deutlich die sensorischen und motorischen Phänotypen aus, die an verschiedenen Mustern der neurotrophen Faktorgenexpression und anderen biologischen Prozessen beteiligt sind, was die Nervenregeneration beeinflusst. Die vorliegende Studie hat ein Protokoll erstellt, um hochgereinigte Ratinsensorische und motorische Cs und Fibroblasten schneller zu erhalten. Die ventrale Wurzel (Motornerv) und die Rückenwurzel (Sensornerv) von neonatalen Ratten (7 Tage alt) wurden dissoziiert und die Zellen wurden für 4-5 Tage kultiviert, gefolgt von isolierungs- und motorischen Fibroblasten und SCs durch die Kombination von Differentialverdauung und Differentialhaftungsmethoden nacheinander. Die Ergebnisse der Immunzytochemie und der Durchflusszytometrie-Analysen zeigten, dass die Reinheit der sensorischen und motorischen SCs und Fibroblasten >90% betrug. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine große Anzahl von sensorischen und motorischen Fibroblasten/SCs schneller zu erhalten und so zur Erforschung der sensorischen und motorischen Nervenregeneration beizutragen.
Introduction
Im peripheren Nervensystem bestehen die Nervenfasern hauptsächlich aus Axonen, Schwann-Zellen (SCs) und Fibroblasten und enthält auch eine kleine Anzahl von Makrophagen, mikrovaskulären Endothelzellen und Immunzellen1. SCs wickeln die Axone in einem Verhältnis von 1:1 und werden von einer Bindegewebsschicht namens Endoneurium umschlossen. Die Axone werden dann zu Gruppen gebündelt, die Faszikel genannt werden, und jedes Faszikel wird in eine Bindegewebsschicht eingewickelt, die als Perineurium bekannt ist. Schließlich wird die gesamte Nervenfaser in eine Schicht aus Bindegewebe eingewickelt, die als Epineurium bezeichnet wird. Im Endoneurium besteht die gesamte Zellpopulation aus 48% SCs, und ein erheblicher Teil der verbleibenden Zellen umfasst Fibroblasten2. Darüber hinaus sind Fibroblasten wichtige Bestandteile aller Nervenkompartimente, einschließlich des Epineuriums, des Perineuriums und des Endoneuriums3. Viele Studien haben gezeigt, dass SCs und Fibroblasten eine entscheidende Rolle im Regenerationsprozess nach peripheren Nervenverletzungen4,5,6spielen. Nach der Transektion des peripheren Nervs regulieren die perineurialen Fibroblasten die Zellsortierung über den Ephrin-B/EphB2-Signalweg zwischen SCs und Fibroblasten und leiten das axonale Nachwachsen durch Wunden5. Periphere Nervenfibroblasten sezernieren Tenascin-C-Protein und verbessern die Migration von SCs während der Nervenregeneration durch den Signalweg7. Die in den oben genannten Studien verwendeten SCs und Fibroblasten wurden jedoch vom Ischiasnerv abgeleitet, der sowohl sensorische als auch motorische Nerven umfasst.
Im peripheren Nervensystem leiten die Sinnesnerven (afferent nerven) sensorische Signale von den Rezeptoren an das zentralnervousische System (ZNS), während die motorischen Nerven (effeente Nerven) Signale vom ZNS an die Muskeln leiten. Frühere Studien haben gezeigt, dass SCs unterschiedliche motorische und sensorische Phänotypen exprimieren und neurotrophe Faktoren absondern, um die periphere Nervenregeneration zu unterstützen8,9. Laut einer aktuellen Studie exprimieren Fibroblasten auch verschiedene motorische und sensorische Phänotypen und beeinflussen die Migration von SCs10. So ermöglicht uns die Erforschung von Unterschieden zwischen motorischen und sensorischen Nervenfibroblasten/SCs, die komplizierten zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der peripheren nervenspezifischen Regeneration zu untersuchen.
Derzeit gibt es viele Möglichkeiten, SCs und Fibroblasten zu reinigen, einschließlich der Anwendung von Antimitatika, Antikörper-vermittelte Zytolyse11,12, sequentielle Immunpanning13 und Laminin substratum14. Alle oben genannten Methoden entfernen jedoch Fibroblasten und bewahren nur die SCs. Hochgereinigte SCs und Fibroblasten können durch Durchflusszytometrie-Sortiertechnologie15erhalten werden, aber es ist eine zeitaufwändige und kostspielige Technik. Daher wurde in dieser Studie eine einfache Differentialverdauungs- und Differentialhaftungsmethode zur Reinigung und Isolierung von sensorischen und motorischen Nervenfibroblasten und SCs entwickelt, um eine große Anzahl von Fibroblasten und SCs schneller zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zu den beiden Hauptzellpopulationen peripherer Nerven gehörten SCs und Fibroblasten. Die hauptsächlich kultivierten Fibroblasten und SCs können bei der Modellierung der Physiologie von Fibroblasten und SCs während der peripheren Nervenentwicklung und -regeneration genau helfen. Die Studie zeigte, dass P7-Ratten-Schitik-Nervenzellen etwa 85% der S100-positiven SCs, 13% der OX7-positiven Fibroblasten und nur 1,5% der OX42-positiven Makrophagen13enthielten. Obwohl die Anzahl der Fibroblasten klei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), der National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927) unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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