Summary
우리는 쥐에 있는 이종 성 복부 심혼 이식의 모형을 기술합니다, 현재 전략의 수정을 암시하는, 이는 단순화한 외과 접근으로 이끌어 내는. 추가적으로, 우리는 쥐에 있는 추가 이식 면역학 분석을 허용하는 중요한 심장 근육 세포의 귀 주입에 의하여 새로운 거부 모델을 기술합니다.
Abstract
쥐에서의 이종성 심장 이식은 50년 이상 다양한 면역학적 연구에 일반적으로 사용되는 모델이었다. 1964년 첫 번째 설명 이후 몇 가지 수정 사항이 보고되었습니다. 쥐에서 이종성 심장 이식을 수행 30 년 후, 우리는 쉽게 가르치고 추가 수술 훈련이나 배경없이 수행 할 수있는 단순화 된 수술 접근 방식을 개발했다.
오름차순 대동맥과 우수하고 열등한 기병 및 폐 정맥의 폐 동맥 및 결찰을 해부한 후, 기증자 심장을 수확하고 이어서 헤파린으로 보충 된 얼음 차가운 식염수 용액으로 관류합니다. 수용인 복부 혈관을 클램핑하고 절개한 후, 기증자는 오름차순 대동맥과 폐 동맥을 각각 연속 적인 실행 봉합사를 사용하여 수용자 복부 대동맥 및 열등한 정맥에 해부학됩니다.
다른 기증자-수령인 조합에 따라, 이 모형은 동종 이식의 급성 또는 만성 거부의 분석을 허용합니다. 이 모형의 면역학 중요성은 중요한 심장 근육 세포의 귀 주입의 새로운 접근 및 배수 자궁 경관 림프조직의 후속 분석에 의해 더욱 강화됩니다.
Introduction
이종성 심장 이식은 이식 허용 오차, 급성 및 만성 동종 이식 거부, 허혈 재관류 손상, 기계 관류 또는 심장 리모델링에 관한 다양한 조사를 위해 자주 사용되는 실험 모델입니다. 다른 장점 들 중에서도, 이식 기능은 촉진및 이식 실패에 의해 비침습적으로 모니터링될 수 있으며 신장이나 간과 같은 다른 장기와 달리 수용자의 중요한 손상을 유발하지 않는다.
에서 1964, Abbott 외. 처음에 쥐에 이종 성 복 부 심장 이식 설명1. 나중에, 1966년에, 해부학을 위한 종단 간 기술은 Tomita 등2에의해 기술되었습니다. 현재 사용되는 모델의 기초는 1969 년 오노와 린지에 의해보고되었다3. 지난 수십 년 동안, 결합된 이종성 심폐 이식4,,5,,6을포함하여 언로드, 부분적으로 로드되거나 로드된 좌심실 심장 이식의 다른 모형을 만들기 위하여 몇몇 수정이 간행되었습니다. 면역학 분석을 위해 비부적 부하 심장 이식 이식이 가장 일반적으로 수행됩니다. 이 경우, 혈류는 기증자가 대동맥을 상승하고 이어서 관상 동맥으로 역행하게 들어간다. 정맥 배수는 관상 동맥 부비동을 따라 오른쪽 심방과 심실로 발생합니다(그림 1A-B). 따라서 좌심실은 테베시안 정맥에서 혈액의 한계 양을 제외하고 혈류에서 제외됩니다. 이것은 또한 좌심실 보조 장치 치료 동안 병리 생리학적 메커니즘을 연구하기 위한 유용한 모형7.
이종성 심장 이식은 마우스, 토끼, 돼지 등 다양한 종에서 수행되어 왔으며 심지어 인간8,9,10,,11에서단일 또는 쌍심실 보조 장치로 사용되어 왔다.9, 쥐는 여전히 이식 모델에 대한 인기 있는 실험 동물을 나타내며, 특히 상이한 쥐 균주 조합에 대한 이식 편이식 생존 시간이 과거에 잘 정의되어 왔기 때문에 많은 수의 면역학적 시약이 접근가능12,,13. 마우스와는 달리, 쥐는 면역학적 분석을 위한 림프 조직에 더 큰 만들기 수술 및 접근이 더 실현 가능한12입니다. 더욱이, 최근 래트에서 상업적 복제 기술의 도입은 실험적인 쥐모델(14)에대한 반복적인 관심을 유도할 가능성이 크다.
일반적으로, 이종성 심장 이식편은 자궁 경부 또는 복부 해부학을 수행함으로써 수용자 혈관에 부착될 수 있다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 대퇴문 해부학이 수동 촉진 또는 경피 심초음파에 대한 더 나은 접근 때문에 향상한 감시를 용이하게 하고 이렇게 접목 실패의 더 정확한 검출을 허용한다는 것을건의합니다 15,,16.
동작 시간, 합병증 비율, 결과 및 이식편 생존 시간에 관한 차이가 없는 것으로 나타났다17. 분명히, 충분한 수의 배수 림프절의 가용성은 자궁 경부 해부학의 이점으로 언급되어야합니다. 그러나, 더 긴 훈련 기간이 필요합니다. 대조적으로, 복부 문합은 면역 학적 조사를 위해 덜 복잡하고 동등하게 가치가 있습니다, 특히 알로겐성 심장 근육 세포및 후속 자궁 경부 림프절 절제술의 귀 내 주사의 새로운 방법의 결과와 결합 될 때. 두 모델의 조합은 개입 후 면역 학적 분석의 광범위한 스펙트럼을 제공합니다.
다음 프로토콜은 허혈 시간을 줄이기 위해 외과 의사의 쌍으로 작동을 말합니다. 그러나, 모든 실험은 한 사람에 의해 수행 될 수있다. 심장 박식 및 이식을 위한 기기 및 재료의 설정은 그림 2A-B에표시됩니다.
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Protocol
모든 동물 체험은 니더작센(LAVES, 올덴부르크, 독일)의 소비자 보호 및 식품 안전을 위해 지역 당국의 지역 윤리 동물 검토 위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 승인 된 IDs 12/0768 및 17/2472.
1. 심장 박식 및 관류
참고: 접목 기증자로서, 7-22주 령의 나이에 암컷 또는 수컷 쥐가 사용되었다.
- 이소플루란 흡입으로 기증자 쥐를 마취시요(5%에서 유도,O2 1L/min의 3%로 유지보수). 주입 5 카프로펜의 mg 을 피하 적으로 perioperative 진통에 대 한 체중의 킬로그램 당 고 투 박 금 반사의 부재에 대 한 확인.
- 눈 윤활제를 바르고 기계식 클리퍼를 사용하여 복부 및 흉부 털을 제거합니다.
- 기증자를 척추 위치에 놓고, 탄력있는 밴드로 수술 대위에 사지를 고정하고 70 % 에탄올 또는 다른 충분한 대안으로 피부를 살균하십시오.
- 국소 마취제 의 적용 후 세로 방향으로 피부를 절개 (예를 들어, 리도카인 0.2 %) 가위를 사용하여 중간 개복술을 수행합니다.
- 리트랙터를 삽입하고, 기증자의 왼쪽에 소장을 동원하고, 멸균 된 면봉으로 열등한 정맥을 노출하십시오.
- 항응고를 위해, 열등한 베나 카바를 천공하여 얼음-차가운 동위 원소 식염수 용액 1 mL에 용해된 헤파린 500 I.U.를 정맥내로 주입한다. 바늘을 철회 한 후 면봉으로 가벼운 압축으로 펑크 부위에서 출혈을 멈춥니다(그림 3A).
- 다이어프램을 절개하고 기증자의 양쪽에 측면 대두 절제술을 수행합니다.
- 흉부의 동원된 복부 벽을 수술대에 고정합니다.
- 두 개의 마이크로 니들 홀더를 사용하여 무딘 준비로 심낭과 미근 신경을 제거합니다.
- 기증자를 추방하고 심장을 내리기 위해 복부 혈관의 절제술을 수행하십시오.
- 프로브 의 무딘 분기를 트랜스버 심낭 부비동에 삽입하고 젖은 압축으로 심장의 가벼운 코그트랙 견인하에 가능한 한 말단으로 승천 대동맥과 폐 동맥을 분리합니다(그림 3B).
- 우수하고 열등한 정맥과 폐 정맥 주위에 단일 5-0 합자를 놓고 가능한 한 등등으로 조입니다(그림 3C).
- 조직을 등도를 합자에 분리하고 심장을 추출합니다(도3D).
- 이식된 심장을 정맥 카테터로부터 오름차순 으로 캐뉼라와 폐 동맥을 통해 30 mL의 얼음-차가운, 이소톤 식염수 용액을 1000 I.U.로 보충하고 15 mL 튜브에 심장을 얼음에 담사(그림3E-F)로주입하였다.
2. 심장 이식
참고: 수령인으로, 10-14 주 오래 된 여성 또는 남성 쥐 사용 되었다. 기증자와 수령인은 대략 무게가 일치했습니다.
- 또한 isoflurane 흡입을 사용하여 받는 쥐의 마취를 수행 (5 %에서 유도 및 유지 보수 1.5-2% O2 의 흐름 1 L / 분). 주입 5 카프로펜의 mg 을 피하 적으로 perioperative 진통에 대 한 체중의 킬로그램 당 고 투 박 금 반사의 부재에 대 한 확인.
- 눈 윤활제를 바르고, 복부 털을 제거하고, 팔다리를 고치고, 기증자 준비와 유사하게 피부를 살균하십시오. 최적의 수술 후 결과를 위해, 수술 중 저체온증을 방지하기 위해 가열 매트에 작업을 수행합니다.
- 피부의 세로 절개 후, 복부 근막에 리도카인 (0.2 %)과 같은 국소 마취제를 적용하십시오. 중간 개복술로 복강을 열고 리트랙터를 삽입합니다.
- 수령인의 왼쪽 상단에 소장을 동원하고 따뜻하고 젖은 압축에 놓습니다.
- 십이지장과 근위축을 각각 동원한 후, 5-7배 배율로 수술용 현미경(또는 돋보기)을 사용하여 면봉으로 무딘 제제로 복부 대류와 열등한 정맥을 노출시켰다. 복부 혈관을 분리하지 마십시오.
- 요추 정맥을 손상시키지 않고 두 개의 마이크로 니들 홀더를 사용하여 복부 혈관을 높이고 쿨리 혈관 클램프를 배치합니다(그림 4A).
- 30-45 ° 아치형 27 G 캐뉼라로 복부 혈관을 뚫습니다(그림 4B).
- Potts 가위를 사용하여 천자 부위를 확대하여 기증자 혈관의 내강 크기와 일치하는 세로 절개를 만들고(그림 4C-D)응고를 제거하고 수술 후 혈전증을 예방하기 위해 수용자 혈관에 식염수 용액을 주입합니다.
- 이식편을 소동에 넣고 기증자가 오름차순을 두 개의 간단한 중단 바늘로 받는 복부 대동맥에 고정시다 (8-0) 세로 절개절의 두개골 및 꼬리 모서리에서 모노필라멘트 비-재음봉합사(그림4E).
- 8-0을 실행하여 수령인의 복부 대와 기증자의 오름차순 대단을 anastomose 두 단계로 모모노 필라멘트 봉합사 : 먼저, 수신자 혈관의 오른쪽에 접목을 배치하고 해부학의 전반을 수행(그림 4E). 이어서, 접목을 수용자 혈관의 왼쪽에 놓고 해부학의 후반을 수행한다(그림 4F).
- 대동맥 항문과 유사하게 열등한 정맥에 공여폐 동맥을 고정 (8-0) 모노필라멘트 비-레서블 봉합사). 혈관의 내발측에서 정맥 해부학의 전반부를 봉합(그림 4G-H).
- 말초 색전증을 방지하기 위해 매듭을 조이기 전에 식염수로 해부학을 직접 씻어 내보하십시오.
- 지혈 거즈를 두 해부학 주위에 놓고 이식의 재관류가 시작될 수 있도록 쿨리 혈관 클램프를 조심스럽게 놓습니다. 살균 된 면봉으로 가벼운 압축으로 해부학을 따라 출혈을 처리하십시오.
참고 : 접목은 약 60 초 후에 치기 시작해야합니다. - 장내를 패션과 같은 구불구불한 것으로 교체하십시오. 장 내 괴사 또는 기계적 방해를 방지하기 위해 장간막 방랑색의 부회전이 없는지 확인하십시오.
- 연속 3-0 폴리 필라멘트 실행 봉합사를 사용하여 복부 근육 / 근막과 피부를 별도로 닫습니다.
3. 수술 후 치료
- 수술 후 진통의 경우, 첫 번째 수술 후 날 (POD)에 체중 kg 당 카프로펜 5 mg의 추가 피하 주사를 수령인에게 공급하십시오. 또한, 세 번째 POD까지 500 mL의 식수에 메타미졸 1 g을 추가하십시오.
- 세 번째 POD에서 매일 복부 촉진으로 심장 이식 기능을 모니터링하기 시작합니다.
참고 : 세 번째 POD 전에 접목 실패의 경우, 면역 장애보다는 수술을 고려해야합니다. 그러나, 이것은 물론 선택된 균주 조합 및 각각의 면역학적 모델(예를 들어, 사전 예방 접종 후과급성 거부)에 의존한다. - 이식 거부 에 이어, 유세포 분석 또는 면역 조직 화학을 통해 추가 면역학 분석을 위한 해부학, 비장, 혈액, 흉선 및 이식의 배수 후배 회액 림프절 과 같은 조직을 추출합니다.
4. 심장의 효소 소화와 귀에 심장 세포의 피하 주입
- 이종성 심장 이식과 유사하게 심장 박식 및 관류를 수행합니다(1단계 참조).
- 멸균 메스 또는 멸균 가위를 사용하여 3 mm x 3 mm 블록으로 심장을 파쇄하고 0.5 mg / mL 콜라게나아제를 함유 한 배양 배지에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
참고: 특히 FCS가 콜라게나아제 소화를 억제하기 때문에 태아 송아지 혈청(FCS)없이 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민을 함유한 배양 배지를 사용하는 것이 중요합니다. - 소화 된 조직을 큰 체에 추가하면서 배양 배지를 제거하고 철저히 다진 후 중요한 심장 근육 세포, 주로 죽은 단일 심장 세포 및 남아있는 혈액 세포의 현탁액을 얻습니다. 멸균 동위 원소 식염수로 셀 서스펜션을 두 번 씻으소서.
참고 : 원심 분리 설정 : 10 분, 200 x g, 20 °C - 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 현탁액을 걸러내고 동위 원소 식염수 용액의 5-10 mL로 세포 스트레이너를 플러시하여 중요한 세포 붕어를 수집합니다.
- 원심 분리 후, 5x105 세포/mL의 농도로 용해된 식염수로 심장 근육 세포를 다시 중단하고 세포 용액을 1 mL 주사기로 끌어올.
- 이종성 심장 이식에 대해 수용인 마취(단계 2 참조)에 대해 기재된 프로토콜과 유사하게 마취를 수행한다.
- 양면 테이프를 사용하여 수신자를 측면 위치에 놓고 손가락으로 귀를 고정합니다(그림5A).
- 27 G cannula s.c.를 통해 심장 근육 세포 용액 (1 x 104 세포 포함)의 20 μL을 시각적 모세관 혈관에 가까운 수령인의 귀에 주입합니다(그림 5B).
- 정의된 관찰 기간(선택된 균주 조합 및 거부강도에 따라), 배수 자궁 경부 림프절을 추출하고 유세포 분석 또는 공동 배양과 같은 추가 분석을 수행한다(그림5C).
참고 : 또한, 피나 조직학적 분석은 세포 침투를 결정하기 위해 수행 될 수있다.
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Representative Results
과거에는 다른 면역학 적 문제가 모델에 기초하여 해결되었으며, 이는 95% 이상의 생존율을 가진 500개 이상의 이식에 의해 작업 군에서 검증되었으며,13,,18,,19,,20,21, 22,,,,23,,24.22 총 작동 시간 (이식 이식 및 이식 포함)은 일반적으로 60 분을 초과하지 않았지만 추위와 따뜻한 허혈 시간을 결합한 시간은 약 30 분이었습니다. 적용 된 변형 조합은 주로 루이스 (Lew) 배경을 기반으로했다. Syngenic 이식은 이식 실패의 표시 없이 100 일까지 살아남았습니다, 그러나 이식 이식 이식시 상당한 무게 및 크기 감소. 가장 최근에, 우리는 빠르고 장기간 거부 모델을 시뮬레이션하는 두 개의 상이한 기증자-수용자 조합에서 이종성 심장 이식을 수행하였다: Lew.1a → Lew wt 빠른 거부(평균 생존 시간 7.4일)와 Lew.1u-7B→ Lew.1a는 더 장기간 거부(평균 생존 시간 42.5일)로이어졌다(도 6). 거시적으로, 거부 된 접목은 선명한 변색과 붓기를 동반한 혈전증을 보였으며, 거부되지 않은 이식편은 부전되지 않은 좌심실의 결과로 뚜렷한 위축을 보였습니다. 또한, 알칼리성 인산염-항알칼리성 인산칼카아제(APAAP) 염색 방법을 사용하여 세포 침투를 검출하기 위해 이식된 심장의 저온 유지 단면을 그렸습니다. 50x 배율을 가진 단일 프레임을 하나의 합성 이미지에 병합하여 전체 접목및 침투 셀의 분포에 대한 개요를 제공합니다. 조직학적 분석은 알로겐 성 이식편에서 면역 세포(예를 들어,CD4+,TCR+또는 NKR-P1A/B+)의침투가 증가한 반면, 합성 이식편은 세포 침투가 크게 없는 것으로 나타났다(그림7A-C).
위에서 언급한 변형 조합에서 심장 근육 세포의 귀 주입 후 림프절 세포를 배수하는 자궁 경부 림프절 절제술 및 재자극 분석은 동종 심장 조직에 대한 뚜렷한 변형 특이적 면역 반응을 밝혀내고 사이토카인 프로파일링과 같은 추가적인 면역학적 분석을 허용하였다(도8A-C).
그림 1: 종단 간 해부학및 심장을 통한 혈류의 개략적 프리젠테이션. 기증자를 상측으로 오름차순으로 복부 대동맥을 포인성 으로 격파한 후, 수용인에게 유사한 폐동맥을 열등한정맥(A)으로,혈류는 오름차순 대동맥을 통해 관상동맥으로 들어간다. 정맥 배수는 부비동 코로나리우스를 통해 오른쪽 심방과 심실로, 그리고 폐 동맥을 통해서 수령인 열등한B정맥 카바(B)로 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 필요한 수술 기구 및 재료. (A)익스피레이션 : 1 : 탄성 사지 밴드, 2 : 탄성 사지 밴드, 2 : 리트랙터, 3 : 5-0 합자, 4 : 프로브 뾰족한 가위, 5-6 : 마이크로 바늘 홀더, 7 : 가위, 8 : 수술 집게, 9 : 마이크로 집게, 10 : 눈 윤활유, 11 : 압축, 12 : 면봉, 13 : 13 : 응고액, 13: 면봉, 13: 탄성 사지 밴드, 4 : 프로브 뾰족한 가위, 5-6 : 마이크로 바늘 홀더, 7 : 가위, 8 : 수술 집게, 9 : 마이크로 집게, 10 : 눈 윤활유, 11 : 면봉, 13 : 13 : 염기, 13 : 응고력 (B)이식: 1: 탄성 사지 밴드, 2: 리트랙터, 5-6: 마이크로 니들 홀더, 7: 가위, 8: 집게, 9: 마이크로 집게, 10: 눈 윤활제, 11: 압축, 12: 면봉, 15: 마이크로 가위, 16: 마이크로 집게, 17: 포츠 가위, 18: 바늘 홀더, 19: 아치형 캐뉼라, 20: 쿨리 클램프 20: 쿨리 클램프 20: 쿨리 클램프 20: 쿨리 클램프 20: 쿨리 클램프 20: 쿨리 클램프 20: 쿨리 클램프 20: 쿨러 20: 쿨러 클램프 20: 쿨리 클램프 20: 쿨리 클램프, 11: 압축, 12: 면봉, 15: 마이크로 가위, 16: 포츠 가위, 18: 아치형 캐뉼라, 20: 쿨리 클램프 20 monofilament 봉합사, 22: 지혈 거즈, 23: 3-0 폴리 필라멘트 봉합사, 24: 페트리 접시, 25: 카프로펜 (5 mg/mL), 26: 국소 마취제 (리도카인 0.2%), 27: 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 심장 재배. 혈뇨(A)후, 대동맥과 폐 동맥을 가능한 한 원위로 절단하고 대동맥을 상승시키는 대동맥 절제술이 수행됩니다(B). 하나의 합자 폐와 두 카발 정맥이 모두 폐색(C)및 심장은 흉강(D)에서제거됩니다. (E)헤파린을 함유한 30 mL 식염수로 관류 후의 심장과(F)전의 심장을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 심장 이식. 복부 혈관의 박람회 및 쿨리 혈관 클램프(A)의배치 후 혈관은 통조림(B)및 종절개포(C-D)를사용하여 수행된다. 기증자 오름차순 대동맥은 수취인 복부 대동맥(E)의 절개의 두개골 및 꼬리 모서리에 각각E하나의 매듭으로 고정되고, 해부학은 지속적으로 봉합사(E-F)를 실행하여 수행된다.E-F 접목은 해부학(E)의전반부와 해부학(F)의후반및 후속 정맥 해부학의 왼쪽에 혈관의 오른쪽에 배치됩니다. 정맥 해부학의 전반부는 내발 봉합사(G)에의해 수행됩니다. 정맥 해부학의 후반을 마친 후, 접목은 재관류(H)에대한 준비가되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 알로겐성 심장 근육 세포의 귀 내 주사. 양면테이프(A)를사용하여 손가락에 수령인의 귀를 고정한 후 유동적인 생명심장 근육 세포를 시각적 모세관(B)에B피하적으로 주입한다. 관찰 기간 후 자궁 경부 림프절(*)을 배출(C)를추출한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 상이한 신생성 및 동종 공여자-수용자 조합에서의 심장 생존. Kaplan-Meier 분석은 syngenic (n=10 빠른 거부 모델; n=5 장기간 거부 모델) 및 동종 이식편(n=11 빠른 거부 모델; n=14 장시간 거부 모델)의 생존을 보여줍니다. 연장된 거부 모델에서 14명의 수령인 중 6명이 접목 실패 없이 관찰 기간(60일)의 끝에 도달하여 이 그룹에서 장기간 이식 생존을 이끌어 냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 합성 및 동종 심장 이식의 조직학적 분석. (A-B)합성 이식편(A)에서 APAAP 염색 방법을 이용한 CD4+세포의 침투를A나타내고, 거부시 동종 이식편(B)을 표시한다.+ B (C)다른 면역 세포 서브세트에 대한 신생성 이식편(기준 군으로 서식)과 비교했을 때 동종 이식편에서 세포 침투의 증가를 제시한다. 세포 침투를 정량화하기 위해 적용된 분류는 히르슈부르크 외25:0 = 신생성 이식편과 유사한 침윤으로부터 변형되었다; 0.5 = 분리 된 조직 섹션에서 염색 된 세포의 약간의 증가; 1 = 전체 조직 섹션에 걸쳐 단수 염색 세포의 증가; 1.5 = 전체 조직 섹션에 균일하게 분포된 스테인드 세포 클러스터의 증가; 2 = 강한; 2.5 = 매우 강한; 3 = 전체 조직 섹션에 걸쳐 스테인드 세포 클러스터의 가장 강한 증가. 접목의 조직학적 섹션은 50배 배율을 사용하여 분석되었다. 그룹당 5개의 이식편(각각 신발생 및 동종)을 분석에 포함하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 알로겐 성 심장 근육 세포의 인귀 주입 후 림프절 세포 배수 분석. 재자극(각각 의기체 균주의 2 x 105 비장세포) 2 x 105 림프구중 하나에서 수확한 자궁 경부 또는 장간막 림프절(LN)의 빠른 거부 Lew wt 및 Lew.1a 수용자를 장기간 거부한 것은 Lew.1a 수용자(A)에서 림프절 세포의 배수증식을 현저히 감소시키는 것으로 나타났으며, 반면 일반적으로 증식 능력은 CD3/CD28 항체(B)를 가진 비특이적 자극 후에도 여전히 관찰할 수 있었다.AB 놀랍게도, 사이토카인 프로파일링은 장기간 거부받는 사람(C)의림프절에서 염증성 사이토카인의 증가를 밝혀냈습니다. 결과는 그룹당 적어도 4마리의 동물의 평균 ±SEM으로서 제시된다. 유의성은 p 값 ≤ 0.05및 p 값 ≤ 0.0001에 대해 *로 표시됩니다. (이 수치는 Beetz 외24에서수정되었습니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
앞서 설명한 쥐의 이종성 심장 이식 방법은 주로 1969년 오노와3린지의 설명에 기초한다 3. 그 이후로, 이 모형의 넓은 다양성으로 이끌어 내는 각종 종에서 몇몇 수정이 소개되었습니다. 이러한 수정의 몇 가지를 결합하고 실험실에서 이종 성 심장 이식을 수행의 30 년 이상에서 발생하는 우리 자신의 경험을 소개, 우리는 긴 훈련 기간이나 수술 배경을 필요로하지 않는 가능한 수술 접근 방식을 만들었습니다. 다음에서는 이 모델의 일반적인 제한 사항에 대해 설명하고 프로토콜의 중요한 단계에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 심장 근육 세포의 귀 내 주입의 새로운 방법과 이종 성 심장 이식의 장점을 강조할 것입니다.
마취 및 일반적인 합병증
이소플루란 마취가 이종성 심장 이식 후 조기 생존에 관한 주사 마취에 우수하다고 보고되었지만, 수술 중 호흡우울증은 여전히 가장 흔한 합병증 중 하나를 나타내므로 신중한 마취 관리가필요하다(26). 직렬 이식 이식 및 이식 대신, 특히 1시간 미만의 수술 시간이 이식 및 수용자 생존에 관한 더 나은 결과와 연관되기 때문에, 특히 기증자 동물의 척수술 직후에 수령인 및 복부 혈관의 준비를 시작하는 것이 좋습니다26,,27. 장내 비생리적 배치에 의한 장괴사 또는 방해로 인한 저체온증 과 같은 저체온증, 그리고 장의 생리학적 배치에 의한 방해와 같은 이미 언급된 합병증 외에도, 사지의 마비는 추가 합병증을 나타내며, 이는 말초 색전증을 피하기 위해 해부학적 혈관 클램핑과 철저한 홍조에 의해 방지될 수 있는 추가 합병증을 나타낸다28.,29
폐 와 기병 정맥및 출혈 합병증의 합자
따뜻한 허혈 시간을 줄이기 위해, 우리는 기병과 네 개의 폐 정맥 모두에 대한 하나의 합자를 사용합니다. 합자의 너무 근위 / 복부 배치로 인한 가능한 합병증으로, 부비동 코로나리우스의 폐색에 의한 정맥 역류의 중단이 언급되어야합니다. 쿨리 클램프를 제거하고 이식편을 가시적 구타 한 후 심한 출혈이있는 경우, 합자는 즉시 불충분을 검사해야합니다. 우리는 특히 폐 정맥의 해부가 흉부 구멍에서 이식편을 제거하면서 합자에 너무 가깝게 수행된 경우 이러한 유형의 합병증을 관찰했습니다. 그렇지 않으면 심한 출혈은 주로 혈관 해부학의 부전으로 인해 발생합니다. 부가적으로, 관상동맥은 증식 시 종종 절단되는 오름차순 대동맥을 따라 흐르며 재관류 시 치명적인 출혈을 일으키도록 기술된다27.
허혈 시간 및 관류
이식 모형에 관계없이, 심혼이 허혈 손상에 관하여 취약한 기관으로 여겨지기 때문에, 허혈 시간을 감소시키기 위하여 항상 필수적입니다. 두 명의 외과 의사와 수술을 수행함으로써, 우리는 최소한의 따뜻하고 차가운 허혈 시간을 달성 할 수 있으며, 따라서 허혈 재관류 손상을 줄이기 위해 심전도 용액의 사용을 포기(30). 일반적으로, 접목의 관류는 중요한 역할을 하고 이식편을 냉각하고 혈전증 또는 색전증을 초래할 수 있는 혈액 세포를 제거하는 것이 필수적입니다. 낮은 관류 압력은 불충분 한 관류로 이어질 따라서 혈액 세포의 불완전한 제거로 이어질 반면, 높은 관류 압력은 내피 손상을 일으킬 수 있습니다31,,32. 우리는 관상 동맥이 눈에 띄게 명확플러시 될 때까지 폐 동맥뿐만 아니라 오름차순 대동맥의 관류를 조언한다.
수령인 선박 절개
프로토콜의 중요한 단계는 혈관 후방 벽에 손상을 일으키지 않고 수용자 혈관의 절개를 구성 : Schmid 등은 작은 횡절절개를 수행하는 대동맥 절제술 또는 venotomy의 이점을 설명하고 두개골 및 검정 방향으로 세로 확대를 수행, 이는 더 감소 협착속도에 이르게3aor anastomos. 우리의 모델에서, 받는 혈관은 작은 캐뉼라를 사용하여 구멍을 뚫습니다. 그 후, 펑크 사이트는 세로 절개를 만들기 위해 Potts 가위를 사용하여 확대됩니다. 더 나은 타당성을 위해 캐뉼라 끝을 30-45° 각도로 구부려 혈관 후방 벽을 손상시킬 위험이 감소하는 것이 좋습니다. 우리는 우리의 수령인중 어느 누구도 임상적으로 관련된 혈관 협조를 관찰하지 않았습니다. 캐뉼라로 복부 대들고 열등한 정맥카바를 천공하여 수령인 혈관을 개설하는 유사한 이점은 Shan et al.34에의해 기술되었다.
이종성 심장 이식 모델 마스터
지난 10 년 동안, 모델은 거의 또는 전혀 수술 배경을 가진 부서의 연구원에 의해 수행되었습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 우리는 외과 의사의 쌍으로 작동, 경험이 풍부한 연구원은 이식의 성공을 보장하고 점차적으로 경험이없는 연구원의 기술 세트를 개선하는 것과 같은 담당하는 반면. 죽은 동물에 약 10 개의 이식 이식 및 이식의 짧은 훈련 기간 후, 경험이없는 연구원은 심장 발산을 수행하고 약 10 마리의 살아있는 동물에서 이식 이식을 돕는 일을 담당합니다. 그 후, 경험이 없는 연구원은 혈관 해부학을 적극적으로 수행하므로 약 10 번의 추가 이식 후, 전 미숙한 연구원은 일반적으로 모델의 모든 중요한 단계를 수행 할 수 있습니다.
이러한 훈련 개념을 적용하면, 쥐에서 이종성 심장 이식을 사용하는 우리 부서의 과거 간행물은 외과 의사13,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24의여러 다른 팀에도 불구하고 이환율, 사망률 또는 이식 기능에 관한 차이를 보이지 않았다.
참고로, 혈관 해부학을 수행하는 것은 일반적으로 이 프로토콜 및 고체 장기 이식 모델에서 가장 중요한 단계를 나타낸다. 따라서, 우리는 해부학이 정확하고 빠른 수행 될 때까지 죽은 동물을 사용하여 장기간 훈련 기간을 권장, 경험이 풍부한 연구원은 살아있는 동물에 지도를 사용할 수없는 경우에 특히.
모델의 일반적인 장점과 단점
자발적 인성 유도는 종종 간 이식에서 현상으로 묘사되고 또한 신장 이식에서 관찰되는 반면, 심장은 오히려 면역 원성 기관으로 간주되어 따라서 이식 모델35,,36에서신뢰할 수있는 거부를 가능하게한다. 이 사실 인정과는 반대로, 우리는 또한 완전한 중요한 조직 적합성 복합적인 격차에도 불구하고 특정 기증자-수령인 조합에 있는 이종 성 심혼 이식 후에 장기 생존 그리고 거부의 부재를 주의할 수 있었습니다.
이종성 심장 이식에 대한 자주 언급되는 비판은 수동 촉진에 의한 이식 편 이식 모니터링의 주관성입니다. 따라서, 모델은 촉진에 대한 접근을 용이하게 하기 위해 대퇴 해부학 기술로 확장되고, 형피심초음파(15,,16)와같은 추가적인 모니터링 기법을 도입한다. 한편, Mottram 등은 촉진을 통한 이식편 모니터링이 심전도 측정과 잘 연관되어 있음을입증했다(37). 따라서, 이종성 심장 이식에서의 수동 촉진은 급성 거부 모델에서 이식기능 모니터링에 충분한 것으로 보인다.
이종 요법 배치 및 좌심실 언로딩의 결과로, 심장은 면역 학적 분석에 영향을 미치지 않는다고 가정하여 해부학적 또는 생리적 조건하에서 작동하지 않습니다. 이러한 가정과는 달리, 좌심실 보조 장치 치료 중 좌심실 하역으로 인한 심장 리모델링이 사이토카인 방출감소(38,,39)로이어지는 것으로 나타났다. 한편, 당-콴 외 는 면역학적 분석을 위한 보다 적절한 접근법으로 언로드된 설정을 설명하였고, 좌심실 부하 모델에서 부분적으로 탈산소혈액을 가진 관류로 인한 이식편의 장기 허혈손상이40개관찰되었기 때문이다.
이식편의 복부 배치는 실용성 면에서 외과적 이점을 제공하지만, 이식 거부시 배수 복강 림프절의 충분한 수를 수확하는 것은 더 많은 분석을 손상시 어렵다. 이러한 이유로, 우리는 알로겐성 심장 근육 세포의 귀 내 주사의 새로운 방법을 소개했습니다. 기생충 연구에서 유래, 이 개념은 이식에 있는 면역학 분석을 위해 적용되지 않았습니다, 그것의 타당성에도 불구하고41,,42. 이 모델의 장점은 복잡한 면역 학적 분석을 수행 할 수있는 가능성을 제공하는 배수 림프절의 상당수를 식별하고 수확 할 수있는 가능성이다. 참고로, 두 모델은 쥐에 있는 세포와 기관 이식에 있는 거부 그리고 관용의 기계장치에 추가 통찰력을 제안하는 1명의 수령인에서 결합될 수 있었습니다.
쥐 심혼 과 심장 근육 세포 이식의 우리의 모형은 실행 가능하고 잘 공부한 접근을 나타내고 추가 외과 훈련 또는 배경 없이 실행될 수 있습니다. 쥐를 위한 새로운 복제 기술이 최근에 소개되고 개발되었다는 사실에 직면, 이 모형은 이식 면역학 연구원을 위한 광대한 기회를 제안합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
브리타 트라우테비히, 코린나 뢰버트, 잉그리드 메더의 헌신에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
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