子结构分析仪：用于荧光显微镜图像中细胞体快速探索和精确分析的用户友好型工作流程
Summary
我们提出了一个自由可用的工作流程，用于在荧光显微镜图像中快速探索和准确分析特定细胞腔中的细胞体。此用户友好的工作流在开源软件 Icy 上设计，并且还使用 ImageJ 功能。在没有图像分析知识的情况下，管道是负担得起的。
Abstract
过去十年的特点是荧光显微镜技术的突破，表现为空间分辨率的提高，但也表现在活细胞成像和高通量显微镜技术。这导致单个实验的显微镜数据的数量和复杂性不断增加。由于对显微镜数据的手动分析非常耗时、主观，并且禁止定量分析，生物图像分析的自动化几乎不可避免。我们构建了一个名为子结构分析器的信息学工作流程，以完全自动化荧光显微镜生物图像中的信号分析。此工作流是在用户友好的开源平台 Icy 上开发的，由 ImageJ 的功能完成。它包括图像的预处理，以提高信号与噪声比，细胞的单独分割（细胞边界的检测）和检测/定量的细胞体丰富在特定的细胞隔间。此工作流程的主要优点是通过用户友好的界面向没有图像分析专业知识的用户提出复杂的生物成像功能。此外，它具有高度模块化，适应几个问题，从核/细胞质转移的特征到不同细胞亚结构中不同细胞体的比较分析。通过研究氧化应激（OS）条件下的Cajal（线圈）体，可以说明此工作流程的功能。来自荧光显微镜的数据表明，在进入操作系统几小时后，它们在人体细胞中的完整性会受到影响。这种效应的特点是线圈核化减少为特征的Cajal体，与线圈素的核质再分配成增加的较小 foci 的数量有关。线圈在CB组件与周围核质之间的交换中的核心作用表明，OS诱导的线圈的再分配可能会影响Cajal实体的组成和功能。
Introduction
光显微镜，特别是荧光显微镜是生物科学中常用的坚固和通用的技术。它们通过特定的荧光标签，获得各种生物分子（如蛋白质或RNA）的精确定位。过去十年的特点是显微镜和成像技术的飞速发展，2014年诺贝尔化学奖授予埃里克·贝齐格、斯特凡·赫尔和威廉·默纳，用于开发超解析荧光显微镜（SRFM）1。SFRM绕过传统光学显微镜的衍射极限，将它引入纳米测量。现场成像或高吞吐量筛选方法等技术的改进也增加了每个实验要处理的数据的数量和复杂性。大多数时候，研究人员面临着细胞的高异质群体，并且想要在单细胞水平上分析表型。
最初，分析，如foci计数是由眼睛执行，这是一些研究人员的首选，因为它提供了对计数过程的完全视觉控制。然而，对此类数据的手动分析过于耗时，导致观察者之间的变异，并且不能访问更复杂的功能，因此计算机辅助方法正在得到广泛使用，几乎不可避免。生物图像信息学方法大大提高了数据分析的效率，没有人工计数分析不可避免的操作主体性和潜在偏差。这一领域需求的增加和计算机功率的提高，导致了大量图像分析平台的发展。其中一些是免费提供的，并允许访问各种工具，以执行分析与个人电脑。开放访问工具的分类最近已建立3，并提出了Icy4作为一个强大的软件结合可用性和功能。此外，冰具有与 ImageJ 通信的优势。
对于没有图像分析专业知识的用户，主要障碍是根据有问题和正确调整通常不被很好地理解的参数选择适当的工具。此外，设置时间通常很长。Icy 提出了一个名为”协议”的用户友好的点击界面，通过组合在详尽的集合 4 中的一些插件来开发工作流。灵活的模块化设计和点击式界面使得非程序员的分析变得可行。在这里，我们提出了一个名为”子结构分析仪”的工作流程，该分析器是在冰的界面中开发的，其功能是分析特定蜂窝隔间中的荧光信号，并测量亮度、foci编号、foci 大小和空间分布等不同要素。此工作流程解决了几个问题，如信号转移的量化、表达荧光报告器的转染细胞分析，或分析单个细胞中不同细胞子结构的 foci。它允许同时处理多个图像，输出结果将导出到选项卡分隔工作表，该工作表可以在常用的电子表格程序中打开。
子结构分析器管道如图1 所示。首先，对指定文件夹中包含的所有图像进行预处理，以提高其信噪比。此步骤可提高以下步骤的效率并缩短运行时间。然后，对与应检测荧光信号的图像区域对应的感兴趣区域 （RO） 进行标识和分段。最后，对荧光信号进行分析，结果导出到选项卡分隔工作表中。
对象分割（边界检测）是图像分析中最具挑战性的一步，其效率决定了生成的细胞测量的准确性。在图像中识别的第一个对象（称为原对象）通常是DNA染色图像（DAPI或霍奇斯特染色）的核，尽管原对象也可以是整个细胞、珠子、斑点、肿瘤或任何染色物体。在大多数生物图像中，细胞或核相互接触或重叠，导致简单而快速的算法失效。迄今为止，没有通用算法能够对所有对象执行完美的分割，主要是因为它们的特性（大小、形状或纹理）调节了分割效率5。通常与显微镜软件一起分发的分段工具（如分子设备变形成像软件6，或尼康7的NIS-元素推进研究软件）通常基于标准技术，如相关匹配、阈值或形态操作。虽然在基本系统中效率很高，但这些过度泛化的方法在更具挑战性和特定性的情况下使用时会迅速产生局限性。事实上，分割对实验参数（如细胞类型、细胞密度或生物标志物）非常敏感，并且经常需要对大型数据集进行重复调整。子结构分析器工作流集成了简单和更复杂的算法，以提出适合图像复杂性和用户需求的不同替代方案。它特别提出了基于标记的流域算法8，用于高聚类对象。此分段方法的效率取决于每个对象上各个标记的选择。这些标记是大多数时间手动选择的，以获得正确的参数进行完全分段，当用户面对大量对象时，这非常耗时。子结构分析仪建议自动检测这些标记，提供高效的分段过程。分割是图像分析的极限步骤，可以根据图像的分辨率、每个图像的对象数和对象的聚类级别大幅修改处理时间。在标准台式计算机上，每个映像需要几秒钟到 5 分钟。分析更复杂的图像可能需要更强大的计算机和图像分析的一些基本知识。
此工作流的灵活性和功能在代表性结果中用各种示例进行了说明。通过研究氧化应激（OS）条件下的核子结构，可以显著地展示这一工作流程的优点。OS 对应于氧化剂的氧化平衡不平衡，并且与高活性氧物种 （ROS） 相关。由于ROS作为信号分子，其浓度和亚细胞定位的变化对无数调节生理功能的通路和网络产生正或负影响，包括信号转导、修复机制、基因表达、细胞死亡和增殖9,9、10。因此，操作系统直接参与各种疾病（神经退行性疾病和心血管疾病，癌症，糖尿病等），但也细胞老化。因此，破译操作系统对人体细胞组织和功能的影响是理解操作系统在人类病理发病和发育中作用的关键一步。已经确定，OS通过调节转录因子（p53，Nrf2，FOXO3A）11来调节基因表达，但也通过影响几个共同和后转录过程的调节，如前RNA12，13，14,13,14的替代拼接（AS）。11主编码和非编码转录的替代方案拼接是一种基本机制，通过生成转录器等构形式来提高基因组的编码能力。AS由一个巨大的核糖核蛋白复合物称为拼接体，包含近300蛋白质和5个U丰富的小型核RNA（UsnRNA）15。拼接体组装和 AS 在细胞中受到严格控制，拼接体成熟的一些步骤发生在名为 Cajal 实体的无膜核隔间内。这些核子结构的特点是其结构及其组成的动态性质，主要通过RNA和蛋白质成分与线圈蛋白的多价相互作用进行。使用子结构分析器工作流程对数千个细胞进行分析，可以对从未描述的操作系统对 Cajal 实体的影响进行表征。事实上，获得的数据表明，OS修改了Cajal实体的核，诱导线圈蛋白的核质再分配到许多较小的核源。卡哈尔体结构的这种变化可能会影响拼接体的成熟，并参与OS的 AS 调制。
Protocol
Representative Results
Discussion
越来越多的自由软件工具可用于分析荧光细胞图像。用户必须根据问题的复杂性、图像处理知识以及在分析中花费的时间正确选择适当的软件。冰，细胞产品，或图像J/斐济是强大的工具，结合了可用性和功能3。Icy 是一个独立工具，它呈现清晰的图形用户界面 （GUI），特别是其”协议”点和点击界面，通过该界面可以轻松设计或操作工作流 4。该软件的功能通过?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. 获得来自微型德莱古埃和辅助技术的研究生奖学金的支持。L.H. 获得洛林大学（ICL）研究生研究金的支持，而Q.T.则由法国国家研究机构（ANR）监督的公共赠款支持，作为第二个”Avenir投资”方案的一部分，FIGHT-HF（参考：ANR-15-RHU457004）。这项工作由全国抵抗军和洛林大学（UMR 7365）资助。
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
Riferimenti
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