Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern
Summary
Wir präsentieren einen frei verfügbaren Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in bestimmten Zellkompartimenten in Fluoreszenzmikroskopiebildern. Dieser benutzerfreundliche Workflow wurde auf der Open-Source-Software Icy entwickelt und verwendet auch ImageJ-Funktionalitäten. Die Pipeline ist ohne Kenntnisse in der Bildanalyse erschwinglich.
Abstract
Das letzte Jahrzehnt war durch Durchbrüche in Fluoreszenzmikroskopie-Techniken gekennzeichnet, die durch die Verbesserung der räumlichen Auflösung, aber auch in Live-Zell-Bildgebung und Hochdurchsatzmikroskopie-Techniken veranschaulicht wurden. Dies führte zu einer stetigen Zunahme der Menge und Komplexität der Mikroskopiedaten für ein einzelnes Experiment. Da die manuelle Analyse von Mikroskopiedaten sehr zeitaufwändig, subjektiv und quantitative Analysen verbietet, wird die Automatisierung der Biobildanalyse nahezu unvermeidbar. Wir haben einen Informatik-Workflow namens Substructure Analyzer entwickelt, um die Signalanalyse in Biobildern aus der fluoreszierenden Mikroskopie vollständig zu automatisieren. Dieser Workflow wird auf der benutzerfreundlichen Open-Source-Plattform Icy entwickelt und durch Funktionalitäten von ImageJ ergänzt. Es umfasst die Vorverarbeitung von Bildern zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses, die individuelle Segmentierung von Zellen (Erkennung von Zellgrenzen) und die Erkennung/Quantifizierung von Zellkörpern, die in bestimmten Zellkompartimen angereichert sind. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, Benutzern komplexe Bio-Imaging-Funktionalitäten ohne Bildanalyse-Expertise über eine benutzerfreundliche Oberfläche vorzuschlagen. Darüber hinaus ist es hochmodular und an mehrere Themen angepasst, von der Charakterisierung der kern-zytoplasmatischen Translokation bis hin zur vergleichenden Analyse verschiedener Zellkörper in verschiedenen zellulären Substrukturen. Die Funktionalität dieses Workflows wird durch die Untersuchung der Cajal (gewickelt) Körper unter oxidativen Stressbedingungen (OS) veranschaulicht. Daten aus der Fluoreszenzmikroskopie zeigen, dass ihre Integrität in menschlichen Zellen wenige Stunden nach der Induktion des Betriebssystems beeinträchtigt wird. Dieser Effekt ist durch eine Abnahme der Coilin-Kernbildung in charakteristische Cajal-Körper gekennzeichnet, verbunden mit einer nukleoplasmatischen Umverteilung von Coilin in eine erhöhte Anzahl kleinerer Brennpunkte. Die zentrale Rolle von Coilin beim Austausch zwischen CB-Komponenten und dem umgebenden Nukleoplasma legt nahe, dass OS-induzierte Umverteilung von Coilin die Zusammensetzung und Die Funktionalität von Cajal Bodies beeinflussen könnte.
Introduction
Die Lichtmikroskopie und insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie sind robuste und vielseitige Techniken, die in den biologischen Wissenschaften häufig eingesetzt werden. Sie geben Zugang zur präzisen Lokalisierung verschiedener Biomoleküle wie Proteine oder RNA durch ihre spezifische fluoreszierende Kennzeichnung. Das letzte Jahrzehnt war geprägt von rasanten Fortschritten in der Mikroskopie und Bildgebungstechnologien, wie der Nobelpreis für Chemie 2014 zeigt, der Eric Betzig, Stefan W. Hell und William E. Moerner für die Entwicklung der superaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie (SRFM)1vergibt. SFRM umgeht die Beugungsgrenze der traditionellen optischen Mikroskopie, um sie in die Nanodimension zu bringen. Die Verbesserung von Techniken wie Live-Imaging oder Screening-Ansätzen mit hohem Durchsatz erhöht auch die Menge und Komplexität der daten, die für jedes Experiment behandelt werden sollen. Meistens sind Forscher mit hohen heterogenen Zellpopulationen konfrontiert und wollen Phänotypen auf einzelliger Ebene analysieren.
Zunächst wurden Analysen wie die Brennweite mit dem Auge durchgeführt, was von einigen Forschern bevorzugt wird, da es eine vollständige visuelle Kontrolle über den Zählprozess bietet. Die manuelle Analyse solcher Daten ist jedoch zu zeitaufwändig, führt zu Einer Variabilität zwischen den Beobachtern und bietet keinen Zugriff auf komplexere Merkmale, so dass computergestützte Ansätze weit verbreitet und nahezu unvermeidbar werden2. Bioimage-Informatik-Methoden erhöhen die Effizienz der Datenanalyse erheblich und sind frei von der unvermeidbaren Bedienersubjektivität und potenziellen Verzerrung der manuellen Zählanalyse. Die gestiegene Nachfrage in diesem Bereich und die Verbesserung der Computerleistung führten zur Entwicklung einer vielzahl von Bildanalyseplattformen. Einige von ihnen sind frei verfügbar und ermöglichen den Zugriff auf verschiedene Tools, um Analysen mit PCs durchzuführen. Eine Klassifizierung von Open-Access-Tools wurde vor kurzem3 eingeführt und präsentiert Icy4 als leistungsstarke Software, die Benutzerfreundlichkeit und Funktionalität kombiniert. Darüber hinaus hat Eis den Vorteil, mit ImageJ zu kommunizieren.
Für Anwender ohne Bildanalyse-Expertise besteht das Haupthindernis darin, das passende Werkzeug entsprechend den problematischen und korrekt abgestimmten Parametern auszuwählen, die oft nicht gut verstanden werden. Darüber hinaus sind die Rüstzeiten oft lang. Icy schlägt eine benutzerfreundliche Point-and-Click-Schnittstelle namens “Protokolle” vor, um den Workflow zu entwickeln, indem einige Plugins kombiniert werden, die in einer erschöpfenden Sammlung gefunden wurden4. Der flexible modulare Aufbau und die Point-and-Click-Schnittstelle machen die Einrichtung einer Analyse für Nicht-Programmierer möglich. Hier stellen wir einen Workflow namens Substructure Analyzervor, der in der Icy-Schnittstelle entwickelt wurde und dessen Funktion darin besteht, fluoreszierende Signale in bestimmten zellulären Kompartimenten zu analysieren und verschiedene Merkmale wie Helligkeit, Brennziffer, Brennpunktegröße und räumliche Verteilung zu messen. Dieser Workflow befasst sich mit mehreren Fragen wie der Quantifizierung der Signaltranslokation, der Analyse transfizierter Zellen, die einen fluoreszierenden Reporter exdrücken, oder der Analyse von Brennpunkten aus verschiedenen zellulären Unterstrukturen in einzelnen Zellen. Es ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Bilder, und Ausgabeergebnisse werden in ein von Registerkarten getrenntes Arbeitsblatt exportiert, das in häufig verwendeten Tabellenkalkulationsprogrammen geöffnet werden kann.
Die Substructure Analyzer-Pipeline ist in Abbildung 1dargestellt. Erstens werden alle Bilder, die in einem angegebenen Ordner enthalten sind, vorverarbeitet, um ihr Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Dieser Schritt erhöht die Effizienz der folgenden Schritte und verringert die Laufzeit. Dann werden die Regionen des Interesses (ROIs), die den Bildbereichen entsprechen, in denen das Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden soll, identifiziert und segmentiert. Schließlich wird das Fluoreszenzsignal analysiert, und die Ergebnisse werden in ein durch Tabstopps getrenntes Arbeitsblatt exportiert.
Die Objektsegmentierung (Erkennung von Grenzen) ist der anspruchsvollste Schritt in der Bildanalyse, und ihre Effizienz bestimmt die Genauigkeit der resultierenden Zellmessungen. Die ersten Objekte, die in einem Bild identifiziert werden (primäre Objekte genannt) sind oft Kerne aus DNA-befleckten Bildern (DAPI- oder Hoechst-Färbung), obwohl primäre Objekte auch ganze Zellen, Perlen, Flecken, Tumoren oder was auch immer gefärbte Objekte sein können. In den meisten biologischen Bildern berühren sich Zellen oder Kerne oder überlappen sich, wodurch die einfachen und schnellen Algorithmen versagen. Bis heute kann kein universeller Algorithmus eine perfekte Segmentierung aller Objekte durchführen, vor allem, weil ihre Eigenschaften (Größe, Form oder Textur) die Effizienz der Segmentierung5modulieren. Die Segmentierungstools, die üblicherweise mit Mikroskopiesoftware vertrieben werden (z. B. die MetaMorph Imaging Software von Molecular Devices6oder die NIS-Elements Advances Research Software von Nikon7), basieren im Allgemeinen auf Standardtechniken wie Korrelationsabgleich, Schwellenwertierung oder morphologischen Operationen. Obwohl diese übergeneralisierten Methoden in grundlegenden Systemen effizient sind, stellen sie schnell Einschränkungen dar, wenn sie in anspruchsvolleren und spezifischeren Kontexten eingesetzt werden. Tatsächlich ist die Segmentierung sehr empfindlich gegenüber experimentellen Parametern wie Zelltyp, Zelldichte oder Biomarkern und erfordert häufig eine wiederholte Anpassung für einen großen Datensatz. Der Substructure Analyzer-Workflow integriert sowohl einfache als auch anspruchsvollere Algorithmen, um verschiedene Alternativen vorzuschlagen, die an die Bildkomplexität und die Benutzeranforderungen angepasst sind. Sie schlägt insbesondere den markerbasierten Wasserscheidealgorithmus8 für stark gruppierte Objekte vor. Die Effizienz dieser Segmentierungsmethode hängt von der Auswahl der einzelnen Marker für jedes Objekt ab. Diese Marker werden die meiste Zeit manuell ausgewählt, um korrekte Parameter für die vollständige Segmentierung zu erhalten, was sehr zeitaufwändig ist, wenn Benutzer mit einer hohen Anzahl von Objekten konfrontiert sind. Substructure Analyzer schlägt eine automatische Erkennung dieser Marker vor und bietet so einen hocheffizienten Segmentierungsprozess. Die Segmentierung ist meistens der einschränkende Schritt der Bildanalyse und kann die Verarbeitungszeit je nach Auflösung des Bildes, der Anzahl der Objekte pro Bild und der Ebene des Clusterings von Objekten erheblich ändern. Typische Pipelines benötigen auf einem Standarddesktopcomputer einige Sekunden bis 5 Minuten pro Bild. Die Analyse komplexerer Bilder kann einen leistungsfähigeren Computer und einige Grundlegendes in der Bildanalyse erfordern.
Die Flexibilität und Funktionalität dieses Workflows wird anhand verschiedener Beispiele in den repräsentativen Ergebnissen veranschaulicht. Die Vorteile dieses Workflows werden vor allem durch die Untersuchung nuklearer Unterstrukturen unter oxidativen Stressbedingungen (OS) deutlich. OS entspricht einem Ungleichgewicht der Redoxhomöostase zugunsten von Oxidationsmitteln und ist mit hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verbunden. Da ROS als Signalmoleküle fungieren, wirken sich Veränderungen in ihrer Konzentration und subzellulären Lokalisation positiv oder negativ auf eine Vielzahl von Signalwegen und Netzwerken aus, die physiologische Funktionen regulieren, einschließlich Signaltransduktion, Reparaturmechanismen, Genexpression, Zelltod und Proliferation9,10. OS ist somit direkt an verschiedenen Pathologien (neurodegenerative und herzkarvaskuläre Erkrankungen, Krebs, Diabetes, etc.), aber auch zelluläreAlterung beteiligt. Daher stellt die Entschlüsselung der Folgen von OS für die Organisation und Funktion der menschlichen Zelle einen entscheidenden Schritt im Verständnis der Rolle von OS beim Beginn und der Entwicklung menschlicher Pathologien dar. Es wurde festgestellt, dass OS die Genexpression reguliert, indem es die Transkription durch mehrere Transkriptionsfaktoren moduliert (p53, Nrf2, FOXO3A)11, aber auch durch die Beeinflussung mehrerer ko- und posttranskriptionaler Prozesse wie alternatives Spleißen (AS) von Pre-RNAs12,13,14. Das alternative Spleißen von primären Kodierungs- und Nicht-Codierungs-Transkripten ist ein wesentlicher Mechanismus, der die Kodierungskapazität der Genome durch die Produktion von Transkript-Isoformen erhöht. AS wird von einem riesigen Ribonukleoprotein-Komplex namens Spliceoom durchgeführt, der fast 300 Proteine und 5 U-reiche kleine nukleare RNAs (UsnRNAs)15enthält. Spliceosome Montage und AS werden in den Zellen streng kontrolliert und einige Schritte der spliceosome Reifung treten in membranlosen Kernräumen namens Cajal Bodies. Diese kerntechnischen Unterstrukturen zeichnen sich durch die Dynamik ihrer Struktur und ihre Zusammensetzung aus, die hauptsächlich durch multivalente Wechselwirkungen ihrer RNA- und Proteinkomponenten mit dem Coilin-Protein erfolgen. Die Analyse von Tausenden von Zellen mit dem Substructure Analyzer-Workflow ermöglichte die Charakterisierung nie beschriebener Os-Effekte auf Cajal Bodies. Tatsächlich deuten die erhaltenen Daten darauf hin, dass OS die Keimbildung von Cajal Bodies modifiziert und eine nukleoplasmatische Umverteilung des Coilin-Proteins in zahlreiche kleinere Kernbrennpunkte induzieren. Eine solche Änderung der Struktur von Cajal Bodies könnte die Reifung des Spliceooms beeinflussen und an der AS-Modulation durch OS teilnehmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die Analyse von Fluoreszenzzellbildern stehen immer mehr freie Software-Tools zur Verfügung. Benutzer müssen die geeignete Software entsprechend der Komplexität ihres Problems, ihrem Wissen in der Bildverarbeitung und der Zeit, die sie in ihrer Analyse verbringen möchten, richtig auswählen. Icy, CellProfiler oder ImageJ/Fiji sind leistungsstarke Tools, die sowohl Benutzerfreundlichkeit als auch Funktionalität kombinieren3. Icy ist ein eigenständiges Tool, das eine klare grafische Benut…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. wurde durch ein Graduiertenstipendium des Ministére Délégué é la Recherche et aux Technologies unterstützt. L.H. wurde durch ein Graduiertenstipendium des Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL) unterstützt, während Q.T. durch ein öffentliches Stipendium unterstützt wurde, das von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) im Rahmen des zweiten Programms “Investissements d’Avenir” FIGHT-HF (Referenz: ANR-15-RHU4570004) überwacht wurde. Diese Arbeit wurde von CNRS und der Université de Lorraine (UMR 7365) finanziert.
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
Riferimenti
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