하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우
Summary
우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.
Abstract
지난 10년 동안 공간 해상도 개선뿐만 아니라 살아있는 세포 이미징 및 고처리량 현미경 기술에서도 도시된 형광 현미경 기술의 돌파구가 특징입니다. 이로 인해 단일 실험에 대한 현미경 데이터의 양과 복잡성이 지속적으로 증가했습니다. 현미경 데이터의 수동 분석은 매우 시간이 많이 걸리고 주관적이며 정량적 분석을 금지하기 때문에 생체 이미지 분석의 자동화는 거의 피할 수 없게되고 있습니다. 우리는 형광 현미경 검사법에서 생체 이미지에서 신호 분석을 완전히 자동화하기 위해 하위 구조 분석기라는 정보학 워크플로우를 구축했습니다. 이 워크플로우는 사용자 친화적인 오픈 소스 플랫폼 Icy에서 개발되었으며 ImageJ의 기능으로 완료됩니다. 그것은 소음 비에 신호, 세포의 개별 세분화 (세포 경계의 검출) 및 특정 세포 구획에서 농축 된 세포 체의 검출 /정량화를 개선하기 위해 이미지의 사전 처리를 포함한다. 이 워크플로우의 주요 장점은 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 이미지 분석 전문 지식 없이 사용자에게 복잡한 바이오 이미징 기능을 제안하는 것입니다. 더욱이, 그것은 매우 모듈식이며 핵 /세포 분석 전대의 특성화에서 다른 세포 하위 구조에서 다른 세포 체의 비교 분석에 이르기까지 여러 문제에 적응한다. 이 워크플로우의 기능은 산화 스트레스(OS) 조건 하에서 Cajal(코일) 바디의 연구를 통해 설명됩니다. 형광 현미경 검사법의 데이터는 인간 세포에 있는 그들의 무결성이 OS의 유도 후에 몇 시간 영향을 받았다는 것을 보여줍니다. 이러한 효과는 코일린의 핵재분배와 연관된 코일린 핵형성의 감소를 특성형 카잘 체체로 감소시켜 더 작은 포시 수로 재분배하는 것을 특징으로 한다. CB 성분과 주변 뉴클레오플라즘 사이의 교환에서 코일린의 중심 역할은 코일린의 OS 유도 재분배가 Cajal Body의 조성 및 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
Introduction
가벼운 현미경 검사법과 특히 형광 현미경 검사는 생물 과학에서 일반적으로 사용되는 견고하고 다재다능한 기술입니다. 그(것)들은 그들의 특정 형광 표시를 통해 단백질 또는 RNA 같이 각종 생체 분자의 정확한 현지화에 접근을 줍니다. 지난 10년 동안 에릭 베치그, 스테판 W. 지옥, 윌리엄 E. 모너가 슈퍼 해결형 형광 현미경 검사법(SRFM)1의개발을 수여한 2014년 노벨 화학상에서 입증된 바와 같이 현미경 및 이미징 기술의 급속한 발전이 특징지어졌습니다. SFRM은 나노 크기로 가져오기 위해 기존의 광학 현미경 검사법의 회절 한계를 우회합니다. 라이브 이미징 또는 높은 처리량 스크리닝 접근법과 같은 기술의 개선은 또한 각 실험에 대해 치료할 데이터의 양과 복잡성을 증가시킵니다. 대부분의 경우 연구자들은 세포의 이질적인 집단에 직면하고 단일 세포 수준에서 표현형을 분석하고자 합니다.
처음에, foci 계산과 같은 분석은 계산 프로세스를 완전히 시각적인 통제를 제공하기 때문에 몇몇 연구원에 의해 선호되는 눈에 의해 수행되었습니다. 그러나 이러한 데이터의 수동 분석은 너무 오래 걸리고 관찰자 간의 가변성을 유발하며 컴퓨터 지원 접근 방식이 널리 사용되고 거의 피할 수 없는2가되도록 보다 복잡한 기능에 대한 액세스를 제공하지 않습니다. 생체 이미지 정보학 방법은 데이터 분석의 효율성을 크게 향상시키고 수동 계수 분석의 피할 수 없는 작업자 주관성과 잠재적 편향이 없습니다. 이 분야의 수요 증가와 컴퓨터 전력의 개선으로 인해 많은 수의 이미지 분석 플랫폼이 개발되었습니다. 그들 중 일부는 자유롭게 사용할 수 있으며 개인용 컴퓨터로 분석을 수행하기 위해 다양한 도구에 액세스 할 수 있습니다. 오픈 액세스 도구의 분류는 최근 설립되었습니다3 유용성과 기능을 결합하는 강력한 소프트웨어로 얼음4를 제시한다. 또한, 얼음은 ImageJ와 통신의 장점이있다.
이미지 분석 전문 지식이 없는 사용자의 경우 주요 장애물은 문제가 있는 매개 변수에 따라 적절한 도구를 선택하고 잘 이해하지 못하는 매개 변수를 올바르게 조정하는 것입니다. 또한 설정 시간은 종종 깁니다. Icy는 “프로토콜”이라는 사용자 친화적인 포인트 앤 클릭 인터페이스를 제안하여 전체 컬렉션4내에서 발견되는 일부 플러그인을 결합하여 워크플로우를 개발할 수 있습니다. 유연한 모듈식 설계와 포인트 앤 클릭 인터페이스를 통해 프로그래머가 아닌 사람들에게 가능한 분석을 설정할 수 있습니다. 여기서 우리는 특정 셀룰러 구획에서 형광 신호를 분석하고 밝기, foci 수, foci 크기 및 공간 분포와 같은 다양한 기능을 측정하는 Icy의 인터페이스에서 개발 된 하위 구조 분석기라는워크플로우를 제공합니다. 이 워크플로우는 신호 전좌의 정량화, 형광 기자를 발현하는 전감염된 세포의 분석, 또는 개별 세포에서 다른 세포 하위 구조에서 의 초점 분석과 같은 몇 가지 문제를 해결합니다. 여러 이미지를 동시에 처리할 수 있으며, 출력 결과를 일반적으로 사용되는 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있는 탭 구분워크시트로 내보낼 수 있습니다.
하위 구조 분석기 파이프라인은 그림 1에표시됩니다. 첫째, 지정된 폴더에 포함된 모든 이미지는 신호 대 노이즈 비율을 개선하기 위해 미리 처리됩니다. 이 단계는 다음 단계의 효율성을 높이고 실행 시간을 줄입니다. 그런 다음 형광 신호를 감지해야 하는 이미지 영역에 대응하는 관심 영역(ROI)이 식별되고 세분화됩니다. 마지막으로 형광 신호를 분석하고 결과는 탭 구분 워크시트로 내보냅니다.
물체 세분화(경계 감지)는 이미지 분석에서 가장 까다로운 단계이며, 그 효율성은 결과 셀 측정의 정확도를 결정합니다. 이미지(1차 개체라고 함)에서 확인된 첫 번째 개체는 DNA 염색 된 이미지 (DAPI 또는 Hoechst 염색)에서 종종 핵이지만 기본 개체는 전체 세포, 구슬, 반점, 종양 또는 얼룩이있는 물체일 수 있습니다. 대부분의 생물학적 이미지에서 세포 또는 핵은 서로 접촉하거나 중첩되어 간단하고 빠른 알고리즘이 실패합니다. 현재까지, 어떤 범용 알고리즘도 모든 객체의 완벽한 세분화를 수행할 수 없으며, 대부분 특성(크기, 모양 또는 텍스처)이 분할5의효율성을 조절하기 때문입니다. 현미경 소프트웨어(예: 분자 장치에 의한 변형 이미징 소프트웨어6또는 Nikon7의NIS-Elements Advances 연구 소프트웨어)와 함께 일반적으로 배포되는 세분화 도구는 일반적으로 상관 관계 일치, 임계값 또는 형태학적 작업과 같은 표준 기술을 기반으로 합니다. 기본 시스템에서는 효율적이지만 이러한 보다 일반화된 메서드는 보다 까다롭고 특정한 컨텍스트에서 사용할 때 한계를 빠르게 제시합니다. 실제로, 세분화는 세포 유형, 세포 밀도 또는 바이오마커와 같은 실험 파라미터에 매우 민감하며, 종종 큰 데이터 세트에 대한 반복적인 조정이 필요하다. 하위 구조 분석기 워크플로는 간단하고 정교한 알고리즘을 통합하여 이미지 복잡성및 사용자 요구에 맞게 다양한 대안을 제안합니다. 특히 고클러스터된 개체에 대한 마커 기반 유역 알고리즘8을 제안합니다. 이 세분화 방법의 효율성은 각 개체의 개별 마커 선택에 의존합니다. 이러한 마커는 사용자가 많은 수의 객체에 직면할 때 매우 많은 시간이 소요되는 전체 세분화에 대한 올바른 매개 변수를 얻기 위해 대부분의 시간을 수동으로 선택합니다. 하위 구조 분석기는 이러한 마커를 자동으로 감지하여 매우 효율적인 세분화 프로세스를 제공합니다. 세분화는, 대부분의 경우 이미지 분석의 제한 단계이며 이미지의 해상도, 이미지당 개체 수 및 개체 의 클러스터링 수준에 따라 처리 시간을 상당히 수정할 수 있습니다. 일반적인 파이프라인은 표준 데스크톱 컴퓨터에서 이미지당 몇 초에서 5분이 필요합니다. 더 복잡한 이미지를 분석하려면 보다 강력한 컴퓨터와 이미지 분석에 대한 몇 가지 기본 지식이 필요할 수 있습니다.
이 워크플로의 유연성과 기능은 대표 결과의 다양한 예제와 함께 설명되어 있습니다. 이 워크플로우의 장점은 특히 산화 스트레스 (OS) 조건하에서 핵 하위 구조의 연구를 통해 표시됩니다. OS는 산화제에 찬성하는 레독스 항상성의 불균형에 대응하고 반응성 산소 종 (ROS)의 높은 수준과 연관된다. ROS는 신호 분자로서 작용하기 때문에, 그들의 농도 및 세포 세포 소소화의 변화는 신호 변환, 수리 메커니즘, 유전자 발현, 세포 사멸 및 증식9,,10을포함하여 생리적 기능을 조절하는 수많은 경로 및 네트워크에 긍정적 또는 부정적으로 영향을 미친다. 따라서 OS는 다양한 병리학 (신경 퇴행성 및 심혈관 질환, 암, 당뇨병 등)뿐만 아니라 세포 노화에도 직접 관여합니다. 따라서 인간 세포의 조직과 기능에 대한 OS의 결과를 해독하는 것은 인간 병리학의 발병 및 개발에서 OS의 역할을 이해하는 데 중요한 단계입니다. OS는 여러 전사 인자(p53, Nrf2, FOXO3A)11을통해 전사를 조절함으로써 유전자 발현을 조절하는 것으로 확립되었지만, 또한 전RNA12,,13,14의대체 접합(AS)과 같은 여러 공동 및 전사 후 과정의조절에영향을 미치는 것으로 확립되었다. 1차 코딩 및 비코딩 전사체의 대체 접합은 전사동형태를 생성하여 게놈의 인코딩 능력을 증가시키는 필수적인 메커니즘이다. AS는 거의 300 단백질과 5 U-풍부한 작은 핵 RNA (UsnRNAs)15를포함하는 spliceosome에게 불린 거대한 ribonucleoprotein 복합체에 의해 수행됩니다. Spliceosome 조립 및 AS는 세포에서 단단히 통제되고 화려한 성숙의 몇몇 단계는 Cajal 바디라는 막없는 핵 구획 내에서 생깁니다. 이러한 핵 하위 구조는 주로 코일린 단백질을 가진 RNA 및 단백질 성분의 다원적 상호 작용에 의해 수행되는 구조와 그 조성물의 동적 특성을 특징으로 합니다. 하위 구조 분석기 워크플로우를 가진 수천 개의 셀을 분석하여 OS가 Cajal Body에 미치는 영향을 설명하지 않은 특성화를 허용했습니다. 실제로, 얻은 데이터는 OS가 카잘 바디의 핵을 수정하고, 수많은 작은 핵 포시로 코일린 단백질의 핵 소플라즈마 재분배를 유도한다는 것을 건의합니다. Cajal 바디의 구조의 이러한 변화는 화려한의 성숙에 영향을 미치고 OS에 의한 AS 변조에 참여할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
형광 세포 이미지의 분석에 사용할 수있는 무료 소프트웨어 도구의 증가가 사용할 수 있습니다. 사용자는 문제가 있는 복잡성, 이미지 처리에 대한 지식 및 분석에 지출하려는 시간에 따라 적절한 소프트웨어를 올바르게 선택해야 합니다. 얼음, 셀 프로파일러, 또는 ImageJ / 피지는 유용성과 기능 모두를 결합하는 강력한도구입니다 3. Icy는 명확한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H.는 미니슈르 델레구에 아 라 레쉐 에 오 테크놀로지스의 대학원 펠로우십에 의해 지원되었다. L.H.는 인스티투트 드 칸세로로지 드 로렌(ICL)의 대학원 펠로우십의 지원을 받았고, Q.T.는 프랑스 국립연구청(ANR)이 감독하는 공공 보조금으로 지원받았고, 두 번째 “인베스트먼트 다베니르” 프로그램 파이트-HF(참조: ANR-15-RHU40)의 일환으로 지원되었다. 이 작품은 CNRS와 유니버시테 드 로렌 (UMR 7365)에 의해 투자되었다.
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
Riferimenti
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