نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للورم الأرومي الدجلي
Summary
هنا، نحن نصف سهل الاستخدام غزو القول للورم الأرومي الدبقي. هذا القول مناسب للخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي. كما يتم وصف ماكرو فيجي لسهولة تقدير كمية الغزو والهجرة والانتشار.
Abstract
ثنائية الأبعاد (2D) الثقافات الخلية لا تحاكي في نمو ورم الجسم الحي مرضية. لذلك ، تم تطوير نماذج كروية الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D). قد تكون هذه النماذج مهمة بشكل خاص في مجال الأورام العصبية. في الواقع، أورام الدماغ لديها ميل لغزو بيئة الدماغ صحية. نحن نصف هنا مثالية 3D الورم الأرومي الجليس spheroid القائم على القول أننا وضعت لدراسة غزو الورم. نحن نقدم جميع التفاصيل التقنية والأدوات التحليلية لتنفيذ هذا القول بنجاح.
Introduction
في معظم الدراسات باستخدام خطوط الخلايا الأولية أو المتاحة تجاريا، يتم تنفيذ المقالات على الخلايا التي تزرع على الأسطح البلاستيكية كثقافات أحادية الطبقات. إدارة ثقافة الخلية في 2D يمثل عيوب، كما أنه لا يحاكي في بيئة الخلية 3D في الجسم الحي. في الثقافات 2D، سطح الخلية بأكملها هو على اتصال مباشر مع المتوسطة، وتغيير نمو الخلايا وتعديل توافر المخدرات. وعلاوة على ذلك، فإن سطح البلاستيك غير الفسيولوجي ة يثير تمايز الخلية1. وقد تم تطوير نماذج ثقافية ثلاثية الأبعاد للتغلب على هذه الصعوبات. لديهم ميزة محاكاة العمارة متعددة الخلايا وعدم تجانس الأورام2، وبالتالي يمكن اعتبارها نموذجًا أكثر ملاءمة للأورام الصلبة3. مورفولوجيا معقدة من spheroids يساهم في تقييم أفضل penetrance المخدرات والمقاومة4. عدم تجانس الورم في السفيرويد يؤثر على انتشار الأكسجين والمواد المغذية ، والاستجابة للعوامل الدوائية(الشكل 1A). يتم تغيير انتشار الأكسجين عندما يصل حجم السفيرويد إلى 300 ميكرومتر ، مما يؤدي إلى بيئة نقص الأكسكة في وسط السفيرويد(الشكل 1A ، C). الأيض هي أيضا أقل اختراق من خلال طبقات الخلية وردود الفعل الأيضية التعويضية تجري5. عندما يزيد قطر السفيرويد ، يمكن ملاحظة النوى النخرية ، مما يزيد من محاكاة الخصائص الموجودة في العديد من أنواع السرطان الصلبة ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي سرطان الدماغ العدواني (GBM)6.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من المقالات الغزو 2D أو 3D للورم الأرومي الدبقي في الأدب7,8. المقالات ثنائية الأبعاد هي أساسا لدراسة الغزو في مستوى أفقي على طبقة مصفوفة رقيقة أو في غرفة Boyden اقدر9. وقد وصفت المقالات ثلاثية الأبعاد مع الثقافات الكروية 3D باستخدام خطوط الخلايا الأرومية الكلاسيكية10. يتم تمثيل المتغيرات الأكثر تعقيدا من قبل غزو الاعضاء في الدماغ من قبل السفير الورم في الثقافات المواجهة11. ومع ذلك، لا يزال من المهم تطوير نسخة سهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ متاحة لأي مختبر. لقد وضعنا بروتوكولا لتوليد الخلايا الجذعية الورم الأرومي الدبقي من عينات المريض. يمكن التحكم بسهولة في القياس الكمي لهذه المقالات ويتطلب فقط برامج مفتوحة الوصول عبر الإنترنت. لفترة وجيزة، يتم قطع قطع الورم إلى قطع صغيرة وهضمها بشكل أنزيمي. تزرع الخلايا المفردة المشتقة من عملية الهضم في الوسط العصبي. بعد 4-7 أيام ، تتشكل هياكل السبرويد تلقائيًا. عند زرع داخل الجمجمة في نماذج الفئران ، فإنها تشكل أورامًا تعرض نواة نخرمحاطة بخلايا زائفة12. هذا يشبه إلى حد كبير الخصائص الموجودة في المرضى GBM.
في هذه المقالة، نحن نصف بروتوكولنا لإنتاج spheroids من عدد محدد من الخلايا لضمان الاستنساخ. يمكن استخدام مصفوفتين متكاملتين لهذا الغرض: Matrigel ونوع الكولاجين I. Matrigel يتم تخصيبه في عوامل النمو ويحاكي الغشاء القاعدي الثديي المطلوب للتعلق بالخلايا والهجرة. من ناحية أخرى ، الكولاجين من النوع الأول ، وهو عنصر هيكلي من ستروما ، هو المصفوفة خارج الخلية الرجفانية الأكثر شيوعًا ويستخدم في المقالات غزو الخلية. هنا، ونحن نوضح نموذجنا SPheroid GBM من خلال تنفيذ الهجرة والانتشار المقالات. تم إجراء التحليل ليس فقط في نقاط زمنية محددة ولكن أيضا عن طريق رصد توسع الخلايا وانتقال الخلايا عن طريق التصوير الحي. وعلاوة على ذلك، تم إجراء المجهر الإلكتروني لتصور التفاصيل المورفولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تكييف المقالات السفية الورم بشكل جيد لدراسة خصائص الورم بما في ذلك الانتشار والغزو والهجرة ، فضلا عن موت الخلايا والاستجابة للمخدرات. تغزو الخلايا السرطانية المصفوفة ثلاثية الأبعاد التي تشكل ورمًا صغيرًا غازيًا ، كما رأينا في الشكل 4B, C. خلال العملية الغازية،…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل ترانسكان 2017، ARC 2017، Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et la Charente-Maritime). جورس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU Toulouse).
Materials
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
Riferimenti
- Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
- Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
- Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver’s seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
- Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
- Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Ricerca sul cancro. 68, 7247-7249 (2008).
- Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
- de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter’s Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
- Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).
