Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom
Summary
Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.
Abstract
Zweidimensionale (2D) Zellkulturen imitieren das In-vivo-Tumorwachstum nicht zufriedenstellend. Daher wurden dreidimensionale (3D) Kultursphäroidmodelle entwickelt. Diese Modelle können im Bereich der Neuroonkologie besonders wichtig sein. Tatsächlich haben Hirntumoren die Tendenz, in die gesunde Gehirnumgebung einzudringen. Wir beschreiben hierin einen idealen 3D-Glioblastom-Sphäroid-basierten Assay, den wir entwickelt haben, um Tumorinvasionen zu untersuchen. Wir stellen ihnen alle technischen Details und Analysewerkzeuge zur Verfügung, um diesen Test erfolgreich durchzuführen.
Introduction
In den meisten Studien mit primären oder kommerziell erhältlichen Zelllinien werden Assays an Zellen durchgeführt, die auf Kunststoffoberflächen als Monolayer-Kulturen angebaut werden. Das Verwalten der Zellkultur in 2D stellt Nachteile dar, da sie keine in vivo 3D-Zellenumgebung imitiert. In 2D-Kulturen ist die gesamte Zelloberfläche direkt mit dem Medium in Kontakt, verändert das Zellwachstum und verändert die Verfügbarkeit von Medikamenten. Darüber hinaus löst die nichtphysiologische Kunststoffoberfläche die Zelldifferenzierung1aus. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurden dreidimensionale Kulturmodelle entwickelt. Sie haben den Vorteil, die multizelluläre Architektur und Heterogenität von Tumoren2nachzuahmen, und könnten daher als relevanteres Modell für solide Tumoren betrachtet werden3. Die komplexe Morphologie von Sphäroiden trägt zur besseren Beurteilung von Medikamentendurchschlagskraft und Resistenzbei 4. Die Tumorheterogenität im Sphäroid wirkt sich auf die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen und die Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe aus (Abbildung 1A). Die Diffusion von Sauerstoff wird verändert, wenn die Sphäroidgröße 300 m erreicht, was eine hypoxische Umgebung in der Mitte des Sphäroids induzieren diniert (Abbildung 1A,C). Metaboliten sind auch weniger durch die Zellschichten eindringen und kompensierenmetabolische Reaktionen stattfinden5. Wenn der Durchmesser des Sphäroids zunimmt, können nekrotische Kerne beobachtet werden, die weitere Imitieren von Eigenschaften bei vielen festen Krebsarten, einschließlich des aggressiven Hirntumorglioblastoms (GBM)6.
Mehrere 2D- oder 3D-Invasions-Assays für Glioblastom wurden in der Literatur7,8berichtet. Zweidimensionale Assays sind hauptsächlich für die Untersuchung der Invasion in einer horizontalen Ebene auf einer dünnen Matrixschicht oder in einem Boyden-Kammer-Assay9. Dreidimensionale Assays wurden mit 3D-Sphäroidkulturen mit klassischen Glioblastom-Zelllinien10beschrieben. Komplexere Varianten werden durch die Invasion von Hirnorganoiden durch Tumorsphäride in Konfrontationskulturendargestellt 11. Dennoch ist es wichtig, einen benutzerfreundlichen und reproduzierbaren Assay zu entwickeln, der jedem Labor zur Verfügung steht. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um glioblastom-Stammzellen aus Patientenproben zu erzeugen. Die Quantifizierung dieser Assays ist leicht zu handhaben und erfordert nur Open-Access-Online-Software. Kurz gesagt, Tumorstücke werden in kleine Stücke geschnitten und enzymatisch verdaut. Einzelne Zellen, die aus der Verdauung gewonnen werden, werden in neurobasalen Medien kultiviert. Nach 4-7 Tagen bilden sich spontan Sphäroidstrukturen. Bei der intrakraniellen Implantation in Mäusemodellen bilden sie Tumore, die einen nekrotischen Kern aufweisen, der von Pseudo-Palisading-Zellen umgeben ist12. Dies ähnelt den Merkmalen von GBM-Patienten.
In diesem Artikel beschreiben wir unser Protokoll zur Herstellung von Sphäroiden aus einer bestimmten Anzahl von Zellen, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Dazu können zwei komplementäre Matrizen verwendet werden: Matrigel und Kollagen Typ I. Matrigel ist mit Wachstumsfaktoren angereichert und imitiert die für die Zellanhaftung und Migration erforderliche Säugetierbasalmembran. Auf der anderen Seite ist Kollagen Typ I, ein strukturelles Element von Stroma, die häufigste fibrilläre extrazelluläre Matrix und wird in Zellinvasions-Assays verwendet. Hierin veranschaulichen wir unser GBM Sphäroid-Modell, indem wir Migrations- und Proliferationstests durchführen. Die Analyse erfolgte nicht nur zu festen Zeitpunkten, sondern auch durch die Überwachung der Sphäroidexpansion und Zellbewegung durch Live-Bildgebung. Darüber hinaus wurde die Elektronenmikroskopie durchgeführt, um morphologische Details zu visualisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor-Sphäroid-Assays sind gut geeignet, um Tumoreigenschaften wie Proliferation, Invasion und Migration sowie Zelltod und Medikamentenreaktion zu untersuchen. Krebszellen dringen in die 3D-Matrix ein und bilden einen invasiven Mikrotumor, wie in Abbildung 4B,Czu sehen ist. Während des invasiven Prozesses können Matrix-Metalloproteinasen (MMP) Matrizen, die Tumorzellen13umgeben, und MMP-Inhibitoren (z. B. GM6001 oder Rebimastat) die Zellinvasion be…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon ist Stipendiat des Universitätsklinikums Toulouse (CHU Toulouse).
Materials
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
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