교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

Summary

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

Abstract

2차원(2D) 세포 배양은 생체 내 종양 성장을 만족스럽게 모방하지 않는다. 따라서 3차원(3D) 배양 스페로이드 모델이 개발되었습니다. 이 모형은 신경 종양학의 필드에서 특히 중요할지도 모릅니다. 실제로 뇌종양은 건강한 뇌 환경을 침범하는 경향이 있습니다. 본명은 종양 침범을 연구하기 위해 개발한 이상적인 3D 교모세포종 스페로이드 기반 분석기를 기술한다. 우리는 이 분석방법을 성공적으로 수행하기 위해 모든 기술적 세부 사항과 분석 도구를 제공합니다.

Introduction

1 차 또는 상업적으로 이용 가능한 세포주를 사용하여 대부분의 연구 결과에서는, 단층 배양으로 플라스틱 표면에 성장한 세포에 공아학은 수행됩니다. 2D에서 세포 배양을 관리하는 것은 생체 내 3D 세포 환경을 모방하지 않기 때문에 단점을 나타낸다. 2D 배양물에서, 전체 세포 표면은 배지와 직접 접촉하여 세포 성장을 변화시키고 약물 가용성을 수정한다. 또한, 비 생리학적 플라스틱 표면은 세포 분화를 유발한다^1. 이러한 어려움을 극복하기 위해 3차원 배양 모델이 개발되었습니다. 그(것)들은 종양^2의다세포 건축 및 이질성을 모방하는 이점이 있고, 따라서 고형^종양3를위한 더 관련성 있는 모형으로 여겨질 수 있었다. 스페로이드의 복잡한 형태는 약물 침투및 내성을 더 잘 평가하는 데^{기여합니다 4.} 스페로이드에서의 종양 이질성은 산소 및 영양소의 확산에 영향을 미치고, 약리작용제에 대한반응(도 1A). 산소의 확산은 스페로이드 크기가 300 μm에 도달하면 변경되어 스페로이드 의 중심에 저산소 환경을 유도합니다(그림 1A,C). 대사 산물은 또한 세포 층을 통해서 더 적은 관통및 보상 신진 대사 반응이 일어난다^5. 스페로이드의 직경이 증가하면, 괴사 코어가 관찰될 수 있고, 공격적인 뇌암 교모세포종(GBM)을 포함하여 많은 고형암에서 발견되는 특성을 더욱 모방한다^6.

교모세포종에 대한 몇몇 2D 또는 3D 침략 검칙은 문헌^7,,8에보고되었다. 2차원 분석실험은 주로 얇은 매트릭스 층 또는 보이든 챔버 분석기에서 수평 평면에서 침략을 연구하기 위한 것이다^9. 3차원 실험은 고전적인 교모세포종^{세포주(10)를}사용하여 3D 스페로이드 배양물로 기재되었다. 보다 복잡한 변이체는 대립^{배양체 11에서}종양 스페로이드에 의한 뇌 오르가노이드의 침입으로 표현된다. 그러나, 어떤 실험실든지 에 유효한 사용하기 쉬운 및 재현가능한 분석분석기를 개발하는 것이 아직도 중요합니다. 우리는 환자 샘플에서 교모세포종 줄기 와 같은 세포를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 분석법의 정량화는 쉽게 관리할 수 있으며 개방형 온라인 소프트웨어만 필요합니다. 간단히, 종양 조각은 작은 조각으로 절단하고 효소 소화. 소화에서 파생 된 단일 세포는 신경 기 저 기 에서 재배 됩니다. 4-7 일 후에 스페로이드 구조가 자발적으로 형성됩니다. 마우스 모델에서 두개내 이식 시, 그들은 의사 팔리사딩 세포^(12)에둘러싸인 괴사 코어를 나타내는 종양을 형성한다. 이것은 GBM 환자에서 찾아낸 특성과 밀접하게 유사합니다.

이 문서에서는, 우리는 재현성을 보장하기 위해 결정된 수의 세포에서 스페로이드를 생산하는 우리의 프로토콜을 설명합니다. 두 개의 상보적인 행렬이 이 목적을 위해 사용될 수 있습니다: Matrigel 및 콜라겐 모형 I. Matrigel는 성장 인자에 풍부하고 세포 부착 및 이동을 위해 요구되는 포유류 기저 막을 모방합니다. 다른 한편으로는, 기질의 구조적인 요소인 콜라겐 타입 I은, 가장 일반적인 섬유질 세포외 매트릭스이고 세포 침략 검정에 이용됩니다. 본 명세서에서, 우리는 이동 및 증식 아세술을 수행함으로써 GBM 스페로이드 모델을 설명한다. 분석은 고정된 시점에서뿐만 아니라 라이브 이미징에 의한 스페로이드 팽창 및 세포 움직임을 모니터링하여 수행되었습니다. 또한, 전자 현미경 검사는 형태학적 세부 사항을 시각화하기 위하여 행해졌습니다.

Protocol

통보 된 서면 동의는 모든 환자 (지역 윤리위원회 규정에 따라 노르웨이 베르겐 하우켈랜드 병원에서) 얻었습니다. 우리의 프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 1. 균일 한 크기의 종양 스페로이드의 생성 참고: 줄기형 세포는 이전 기사12에기재된 바와 같이 B27 보충제, 헤파린, FGF-2, 페니실린 및 스트렙토마이…

Representative Results

스페로이드는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고 이동, 침략, 증식 및 현미경 검사법에 관한 관찰이 이루어졌다. 구형 구조의 별개의 영역에서 저산소증을 측정하기 위해, 카르복식 아히드라아제 IX 염색을 저산소 활성을 결정하는 데 사용하였다(도1A-C). 더 많은 CAIX 양성 세포가 스페로이드 센터에서 관찰되었다(그림<strong class="xfi…

Discussion

종양 스페로이드 세포 반응은 세포 사멸 및 약물 반응뿐만 아니라 증식, 침습 및 이동을 포함한 종양 특성을 연구하기 위해 잘 적응된다. 암세포는 그림 4B,C에서볼 수 있듯이 침습성 미세 종양을 형성하는 3D 매트릭스를 침범합니다. 침습 적 과정 동안, 매트릭스 금속 단백질 효소 (MMP) 종양 세포⁽¹³⁾및 MMP 억제제 (예를 들어, GM6001 또는 Rebimastat)를 …

Materials

96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C