Summary
여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.
Abstract
줄무늬 근육 세포는 인간과 동물의 활동에 필수적입니다. 단일 근육 섬유는 근육에서 가장 작은 수축 단위인 직렬로 연결된 사마페로 구성된 myofibrils로 구성됩니다. 육종 장애는 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 돌연변이를 가진 환자에 있는 근육 약점에 기여합니다. myofibril 역학의 연구는 단일 근육 섬유의 수축도 측정 할 때 손상, 인접한 myofibrils의 잠재적 인 혼란 효과없이 액틴 - myosin 상호 작용의 평가를 할 수 있습니다. 근비릴의 초구조적 손상과 정렬 불량은 손상된 수축에 기여할 수 있습니다. 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우, 격리 절차 중 또는 실험 중에 파손 될 가능성이 있습니다. 또한, 근시릴의 연구는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 액틴-미오신 상호작용의 평가를 제공한다. 예를 들면, myofibrils에 있는 측정은 근시릴라 기능 장애가 육종 단백질에 있는 돌연변이의 1 차적인 효력인지 를 해명할 수 있습니다. 또한, 칼슘 솔루션 또는 화합물이 있는 관류는 근시릴의 작은 직경으로 인해 거의 즉각적이다. 이것은 myofibrils가 힘 생산 도중 활성화 그리고 이완의 비율을 측정하기 위하여 탁월하게 적합하게 만듭니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 압전 길이 모터와 빠른 단계 의 관류 시스템에 결합된 나노 뉴턴 범위에서 힘을 측정할 수 있는 Fabry-Pérot 간섭계의 원리에 기초하여 광학 력 프로브를 사용합니다. 이 설정을 통해 고해상도 힘 측정을 통해 myofibril 역학을 연구할 수 있습니다.
Introduction
줄무늬 근육 세포는 일상 생활 활동에 필수적입니다. 사지 운동, 호흡 기능 및 심장의 펌핑 운동은 근육 세포에 의해 생성 된 힘에 의존한다. 골격 근은 단일 근육 섬유의 번들을 포함하는 근육 매심으로 구성됩니다(그림 1A). 이러한 근육 섬유는 직렬로 연결된 사코머(그림1B,D)에의해 형성되는 근시브릴로 구성됩니다. 사혜성에는 얇고 두꺼운 필라멘트가 들어 있습니다. 이들은 주로 액틴과 미오신 분자의 사슬로 구성되며, 각각(도 1B). 액틴-미신 상호 작용은 근육의 힘 생성 능력에 대한 책임이 있습니다. 성운, 액틴 및 트로포닌 T와 같은 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이가있는 환자는 수축 기능 장애1로인한 근육 약화로 고통받고 있습니다.
근육 수축의 품질 조직의 다양 한 수준에서 공부할 수 있습니다., 생체 전체 근육에서 체 외 운동 성 애사에서 actin-myosin 상호 작용에 이르기까지. 지난 수십 년 동안, 몇몇,연구 단은 개별 myofibrils,,2,3,4,45,,5,6,7,8,9,10의수축을 결정하기 위하여 설치를개발했습니다. 이러한 설정은 근시릴의 수축에 의해 유발된 캔틸레버(즉, 광학 빔 편향)로부터 레이저 편향의 변화를 검출하는 데 기초한다(자세한 내용은 라부다 외11참조). 근시 의 수축 기능을 결정하는 데는 몇 가지 한계가 있지만 (예를 들어, 근시 의 상류인 흥분 수축 커플링 프로세스의 역학이 부족함), 이 접근법에는 여러 가지 장점이 있습니다. 여기에는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 경우 액틴-미오신 상호작용을 평가하는 능력; 2) 손상된, 인접한 근막의 잠재적 인 혼동 효과없이 액틴 - 미오신 상호 작용을 평가 할 수있는 능력 (단일 근육 섬유의 수축을 측정 할 때 초구조적 손상과 myofibrils의 정렬 불량에 기여할 수 있음)(그림 1D); 3) 근시 (~1 μm, 도 2A)의작은 직경과 멤브레인의 부족은 사마페에 거의 즉각적인 칼슘 확산을 허용한다. 더욱이, 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우에, 그(것)들은 확률이 그들의 격리 도중 또는 실험 도중 끊어질 것입니다. 따라서, myofibril 수축을 평가하는 것은 근육 수축의 기본 기계장치를 공부하고 방해된 액틴-미신 상호 작용이 육종 단백질에 있는 돌연변이에 기인한 근육 질병의 주요 원인인지 이해하는 우아한 방법입니다.
이 프로토콜은 나노 뉴턴 해상도 (즉, Optiforce)와 캔틸레버 힘 프로브를 통합 근시 릴의 수축을 결정하기 위해 새로 개발 된 설정을 제공합니다. 이 힘 프로브는 간섭법의 원리를 기반으로 합니다. 간섭측정을 통해 비교적 딱딱한 캔틸레버를 사용할 수 있습니다. 이를 통해 칸틸레버의 편향이 거의 없는 힘을 측정하여 근시 브릴리브릴의 이소메트릭 수축에 접근할 수 있습니다. 프로브는 높은 신호 대 잡음 비율로, 인간 과목에서 그 를 포함하여 다른 근육 생검에서 격리 된 단일 근시릴에 의해 생성 되는 낮은 수동 및 활성 힘의 평가에 대 한 수 있습니다. 이 설정에 통합된 광학 캔틸레버 힘 프로브는 Fabry-Pérot 간섭계12를기반으로 합니다. 간섭계는 발효에 장착된 광섬유와 금코팅 캔틸레버 사이의 작은 변위를 감지합니다(그림3). 광섬유와 캔틸레버 사이의 간격을 파브리 페로 캐비티라고 합니다. Myofibrils는 두 개의 접착제 코팅 유리 장착 섬유를 사용하여 프로브와 압착 모터 사이에 장착됩니다. 근시브릴에 의해 생성된 힘은 간섭계 데이터로부터 수학적으로 도출될 수 있다. 간섭측정은 두 개 이상의 파도의 중첩 또는 간섭을 기반으로 합니다(이 설정에서 세 개의 광파). 1,528.77-1,563.85 nm 사이의 파장을 가진 레이저 광은 간섭계에서 방출되고 광섬유를 통해 전송됩니다. 프로브에서 광섬유와 배지 사이의 인터페이스에서 빛이 1) 반사된다(도3A); 2) 매체와 캔틸레버의 인터페이스에서(도 3B); 및 3) 캔틸레버의 금속과 금 코팅 사이의 인터페이스에서(도 3C). 인터페이스 A 및 B의 반사는 프로브가 침수되는 매체의 굴절률(n)에 의존한다.n 세 개의 중첩 된 반사로 구성된 빛은 간섭계의 포토다이오드로 돌아갑니다. 포토다이오드는 빛의 강도를 측정하며, 이는 세 개의 중첩된 반사의 간섭 패턴의 결과입니다. 근시릴을 활성화하거나 스트레칭하여 수축력이 생성되면 근시릴이 캔틸레버를 끌어당깁니다. 이 움직임은 캐비티크기(d)를 변경하고 결과적으로 캐비티에 맞는 파장의 수를 변경합니다. 캔틸레버에 반사되는 빛은 다른 위상을 가지며, 그 결과 다른 간섭 패턴이 생성됩니다. 포토디오드는 볼트의 변화로 간섭 패턴 강도의 변화를 기록합니다. 그 후, myofibril 힘 생성은 이 변경에서 계산됩니다, 고려 캔틸레버 강성을 고려. 포스 프로브는 제조업체에 의해 보정되며, 캔틸레버의 자유 전달 끝에 부착된 마운팅 바늘의 끝을 밀어내고, 계량 스케일에 대해, 캔틸레버의 굽힘은 레아웃레이저(13)의파장의 배수와 동일하게 유지한다. 따라서 간섭법은 거리의 작은 변화를 감지하여 나노 뉴턴 분해능으로 힘을 측정할 수 있는 매우 민감한 방법입니다. 이 해상도를 통해 높은 신호 대 잡음 비율로 myofibrillar 힘 생산을 평가할 수 있습니다. 기존의 간섭 측정은 간섭 곡선의 선형 부분으로 측정 범위를 제한하지만, 레이저 파장의 잠금 증폭기 및 변조를 사용하여 이한계(14)를극복한다. 이 내용은 토론 섹션에서 보다 자세히 설명되어 있습니다.
myofibril 활성 장력을 측정하기 위해, 빠른 단계 관혈 시스템이 통합되어 myofibril을 칼슘 용액(그림4A)에노출시켰다. 빠른 단계 관류 시스템을 통해 10ms 이내에 솔루션 변경이 가능합니다. 직경이 작기 때문에 근비릴로 칼슘 확산이 거의 즉각적입니다. 따라서, 이 시스템은 활성화 및 휴식 중에 방출하는 동안 액틴-미오신 결합의 비율을 측정하는 데 특히 적합하다. 활성화(kACT)및 이완(kREL)의속도는 활성화-이완 곡선으로부터 결정될 수 있다. 또한, 농도가 증가하는 칼슘 용액에 myofibrils를 노출시킴으로써, 힘-칼슘 관계 및 칼슘 민감성을 결정할 수 있다.
또한, 압전 길이 모터는 myofibril의 빠른 스트레칭과 단축을 가능하게합니다. 이는 근시의 점탄성 특성(즉, 수동장력)을 연구할 수 있을 뿐만 아니라, 미오피브릴의 급속한 단축 및 재스트레칭을 수행하여 장력 재개발(kTR)의속도를 결정할 수 있는 가능성을 제공한다. 활성 및 수동 장력 실험모두에서 회수된 파라미터는 육종 단백질의 유전자 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.
이 맞춤형 설정은 건강한 인간, 환자 및 마우스 골격 근육으로부터 분리된 myofibrils의 활성 및 수동 수축 특성을 측정하는 데 사용되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
인간 생검을 얻기 위한 프로토콜은 VU 대학 의료 센터 (#2014/396)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며, 서면 통보 된 동의는 과목에서 얻어졌다. 동물 근육 생검을 얻기위한 프로토콜은 VU 대학의 지역 동물 윤리위원회 (AVD11400202016501)에 의해 승인되었습니다.
1. 준비 및 마이오비브릴 격리
참고: 이전에 설명된 방법을 사용하여 생검을 글리세리네이트하고, 다른 칼슘 농도(pCa) 용액77,16,17을준비하고, 근시2,18을분리한다.,
- -80°C에 저장되는 릴렉스(pCa 9.0, Rx) 및 활성화(pCa 4.5, Act) 용액뿐만 아니라 억제제(1M E64, 1M DTT, 1M leupeptin, 1 M PMSF)를 해동한다.
- 약 1mm3의 글리세라이트 근육 생검을 가져 와서 1:1 Rx /글리세롤 (v /v) 용액으로 작은 페트리 접시에 놓고 페트리 접시를 4 ° C의 냉판에 놓습니다.
- 해부 현미경과 집게를 사용하여 근육의 조각을 해부, 근육의 조각에서 그들을 격리하지 않고 단일 근육 섬유를 분리.
참고: myofibril 현탁액의 오염을 방지하기 위해 가능한 한 많은 지방 및 결합 조직을 제거하십시오. - 해부된 조직의 조각을 1.5mL의 릴렉스 용액(1 μL/mL E-64, 1 μL/mL/mL leupeptin, 1 μL/mL DTT 및 125 μL/mL PMSF)을 사용하여 5mL 튜브로 이송합니다. 조직이 약 4 °C에서 1 h로 템퍼되도록 하십시오.
- 인큐베이션 하는 동안 두 PC를 부팅 하 고 장치를 켜고 관련 소프트웨어를 엽니다 (재료표참조).
- 페트리 접시에 초순수 수에 힘 프로브를 잠그고 프로브를 보정합니다.
- 간섭계에서'시작 마법사'를누르고 화면 지침을 따릅니다. 교정을누르면 현미경 단계를 누릅니다.
참고 : 현미경 단계를 탭하면 캔틸레버가 변두리를 편향시키고 통과하게됩니다. 이렇게 하면 프로브를 교정할 수 있습니다. - 보정 후 페트리 접시에 초순수물에 잠긴 프로브를 둡니다.
- 간섭계에서'시작 마법사'를누르고 화면 지침을 따릅니다. 교정을누르면 현미경 단계를 누릅니다.
- 압착 모터 위치를 초기화합니다. 이렇게 하려면 아래에 설명된 단계 중 하나를 따르십시오.
- 압전 모터가 kTR 장력에 사용될 때 길이를 0μm로 설정합니다.
신호 발생기 설정은 표 1, 그림 5A에서찾을 수 있습니다. - 압압 모터가 수동 장력에 사용될 때 길이를 50 μm로 설정합니다.
신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
참고: 단계의 차이는 압전 길이 모터의 초기 위치입니다. 근시브릴을 스트레칭하기 위해, 압제 모터는 장착 바늘 사이의 거리를 증가시키고 myofibril을 길게하기 위해 당겨야합니다. 근시브릴을 느슨하게하기 위해, 압제 모터는 장착 바늘 사이의 거리를 줄이고 myofibril을 단축하기 위해 밀어해야합니다.
- 압전 모터가 kTR 장력에 사용될 때 길이를 0μm로 설정합니다.
- 현미경 슬라이드를 준비합니다. 피펫 150 μL 폴리 하이드록시틸메트하크레이트(poly-HEMA) 용액(5% 폴리-HEMA 95% 에탄올, w/v)을 현미경 슬라이드에 분산하여 모든 것이 커버되도록 합니다.
참고: 외투되지 않은 현미경 슬라이드에서 myofibril 서스펜션이 파이프로 고정되면 바닥에 가라앉는 myofibrils가 현미경 슬라이드에 달라 붙어 접착제를 붙일 수 없습니다. - pCa 솔루션으로 주사기를 채우고(그림 4A참조) 관류 시스템을 프라임합니다.
참고: 이러한 단계에서 모든 튜브는 모든 기포가 튜브에서 제거되었는지 확인하기 위한 적절한 솔루션으로 미리 채워져 있습니다.- 유동 챔버 배경 흐름의 유입 튜브를 채우면(그림3, 4A)유입을 Rx로 채웁니다.
- 사용 시, 공기를 제거하기 위해 초순수물로 매니폴드를 플러시하십시오. 이렇게하려면 주사기를 초순수 물과 콘센트에 연결하고 역 방향으로 씻어 내도록 합니다. 매니폴드의 사용되지 않는 포트를 차단합니다.
- 각 pCa 주사기를 사용하여 각 튜브를 pCa 솔루션으로 채웁니다. 그런 다음 매니폴드와 Ɵ 유리에 연결합니다.
- 데이터 수집 패널 소프트웨어가 있는 오픈 밸브 1 과 6(재료 표참조)을 확인하여 버튼'1+6'(그림6A)을확인하여 Ɵ 유리를 이완(pCa 9.0)으로 채우고 ƟFigure 6B유리가 채워질 때 밸브를 활성화(4.5)한다.
2. 마이오비브릴 장착
- 현미경 슬라이드를 폴리 HEMA로 코팅하여 myofibrils가 유리에 달라 붙는 것을 방지합니다.
- 균질화에 대한 균질화 (재료의 표참조)를 준비합니다. 깨끗한 티슈 페이퍼로 내부 로터 로드를 청소하고, 균질화제를 조립하고, 15초 동안 1x를 알코올과 세 번째로 초순수수로 돌보세요. 얼음 에 15 s에 대한 편안한 솔루션 1 x에서 균질화제를 prerinse.
- 1.4 단계에서 설명된 바와 같이 근육 조직을 함유하는 튜브에 균질화 막대를 놓고, 튜브를 얼음에 유지하면서, 로터를 5번 속도로 회전하여 근육 조직을 찢고 근시현 액수액을 얻습니다.
- 피펫 ~50 μL 의 myofibril 현탁액및 티슈 목욕에 폴리 HEMA로 코팅 된 현미경 슬라이드에 이완 용액의 ~250 μL. 이것은 액체 방울을 형성합니다. 먼지로부터 보호하기 위해 뚜껑으로 목욕을 덮고 5-10 분 기다린 후 myofibrils가 바닥으로 가라 앉을 수 있도록하십시오.
참고: 서스펜션과 이완 솔루션 사이의 비율은 격리의 품질에 따라 달라지므로 그에 따라 조정합니다. 예를 들어, 미오피브릴 수율이 낮고 현탁액에 적합한 근시릴이 거의 없는 경우, 미오피릴 서스펜션을 더 추가하고 덜 편안한 용액(예: 미오피릴 서스펜션의 75 μL 및 이완용액의 225 μL)으로 희석한다. 심장과 골격 근육 조직은 그 줄무늬 패턴때문에 쉽게 인식할 수 있습니다. 10배 또는 40배 의 목표를 사용하여 이 패턴은 단일 myofibril에서도 볼 수 있습니다. 다른 조직이 현탁액에 존재하는 경우, myofibrils는 시각적으로 선택될 수 있다. 5-10분 대기를 건너뛸 수 있습니다. 그러나, 이것은 myofibril를 접착의 어려움을 증가시킵니다. - 접착제를 가진 코팅 장착 바늘 (셸락 + 에탄올; 120 mg 쉘락2 mL에서 70% 에탄올). 이렇게하려면 접착제를 65 °C에서 30-60 s로 가열하고 파이펫 ~ 6 μL을 새로운 코팅되지 않은 유리 슬라이드에 가열합니다. 각 장착 바늘의 끝을 접착제에 담그고 접착제 층이 보일 때까지 반복합니다. 현미경 단계에 조직 목욕을 배치 할 수있는 공간을 만들기 위해 마이크로 조작기로 프로브와 압소를 수직으로 이동합니다. 접착제가 들어 있는 유리 슬라이드를 제거합니다.
- 미오미브릴 장착
- 현미경 단계에 myofibril 현탁액을 포함하는 폴리 HEMA로 코팅 된 현미경 슬라이드로 조직 목욕을 놓습니다. 스테이지를 사용하여 40배 의 목표를 가진 적합한 myofibril을 찾으십시오. 필요한 경우, 이동 및 장착 가능한 위치로 myofibril을 이동하기 위해 조직 목욕을 회전.
참고: 약 30μm 길이의 눈에 보이는 트트리션 패턴이 있는 myofibrils를 찾습니다. 3.1 및 3.2.1 단계에서 자세히 설명한 바와 같이 근시릴을 접착하기 전에 길이와 사카머 길이를 확인할 수 있다. 이 수축 하는 동안 휴식 가능성이 있기 때문에, 찢어진 myofibrils 접착제 하지 마십시오. - 유동 챔버를 티슈 욕조의 myofibrils를 함유한 액체 낙하 바로 위에 밀어 넣은 다음(2.4단계에서 슬라이드에 파이펫)하고 하강한다. 액체 방울에 닿기 전에 멈춥춥습니다.
- 압전 장착 바늘을 낮추고 근시릴의 하단 끝에 누릅니다. 약간 들어 올려 서 myofibril 바늘에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
- 프로브의 장착 바늘이 유동 챔버를 만지지 않고 바닥에 도달할 수 있을 만큼 유동 챔버를 낮춥다.
- 미오피브릴 의 상단 끝에 있는 프로브의 장착 바늘을 누릅니다. 약간 들어 올려 서 myofibril 바늘에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
- 유리 의 바닥을 만지지 않고 초점을 맞출 수있는 능력을 잃지 않고 가능한 한 목욕의 바닥에서 myofibril을 들어 올립니다.
- 현미경 단계에 myofibril 현탁액을 포함하는 폴리 HEMA로 코팅 된 현미경 슬라이드로 조직 목욕을 놓습니다. 스테이지를 사용하여 40배 의 목표를 가진 적합한 myofibril을 찾으십시오. 필요한 경우, 이동 및 장착 가능한 위치로 myofibril을 이동하기 위해 조직 목욕을 회전.
3. 실험 초기화
- 마이크로 조작기, 카메라 및 시스템 컨트롤러소프트웨어(그림 7A, 재료 표참조)를 사용하여 사컴레 길이를 측정합니다. 압착 및/또는 힘 프로브를 이동하여 근시브릴의 초기 사혜성 길이를 2.5 μm로 설정합니다.
참고: 2.5 μm의 사컴레 길이는 미오신 헤드와 액틴 사이의 최적의 중첩을 보장합니다. - 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 선박 기능을 사용하여 미오피브릴 길이와폭(도 7B,C)을측정합니다.
참고: 카메라를 회전할 때 수평 및/또는 세로로 기울어질 수 있습니다. 카메라의 정렬을 확인하려면 정신 레벨을 사용하여 카메라가 회전하고 기울어지지 않았는지 확인할 수 있습니다.- 현미경 단계를 사용하여 비디오 이미지의 중심에 myofibril을 배치합니다.
- 마이오비브릴의 한쪽에서 다른 쪽으로 정사각형을 그립니다. 길이의 경우 이미지 처리가 대비를 기반으로 하기 때문에 접착제방울(도 2A)의어두운 가장자리를 사각형에 포함해야 합니다.
- 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표 참조)에서데이터 녹화를시작하고5초 후'일시 중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어 데이터 기록을 일시 중지합니다. 길이가 이제 데이터에 기록됩니다.
- 너비의 경우 먼저 카메라를 90° 회전(재료 표참조)한 다음 myofibril 자체의 가장자리의 대비를 사용합니다.
- 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표 참조)에서데이터 녹화를시작하고5초 후'일시 중지' 버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어 데이터 기록을 일시 중지합니다. 이제 너비가 데이터에 기록됩니다.
- myofibril의 활성 장력을 결정해야 하는 경우 관류 설정을 사용해야 합니다. 그렇다면 3.4단계를 계속합니다. 수동 장력만 결정되면 3.4-4.1.3.7 단계를 건너뛰고 4.2단계에서 계속하십시오.
- 포루서셋 설정을 배치하고 초기화합니다.
참고: 이것은 활성 력의 생성에만 필요합니다. 수동 장력 실험을 수행할 때 4.2 단계를 계속합니다.- 4V(그림5B)로빠른 스텝 모터 위치를 설정합니다.
- 테이블에 퍼퓨전 스탠드를 밀어 스탠드의 왼쪽 하단 모서리를 테이블의 테이프와 정렬합니다.
참고: 힘 프로브 나 압제 모터에 충돌하지 않도록주의하십시오. - 조작기를 사용하여 Ɵ 유리를 눈으로 대략 배치합니다.
- 접안렌즈를 살펴보고 Ɵ 유리를 조작기로 미오피릴쪽으로 조심스럽게 이동합니다.
- Ɵ 유리의 상단 채널을 조작기를 사용하여 myofibril과 정렬하고 시스템 컨트롤러소프트웨어(도 2B–C, 재료 표참조)와 빠른 단계(신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있음)를 수행하여 위치를 확인합니다.
참고: 맨 아래 채널이 빠른 단계(그림2B–C)의활성화 단계에서 myofibril과 정렬되는지 확인합니다.Figure 2B
- Rx(도4A)의배경 흐름을 켜서 유동 챔버에서 라미나르 배경 흐름을 만듭니다.
참고: Ɵ 유리에서 pCa 솔루션 흐름의 결과로 난류 흐름을 방지하기 위해 배경 흐름이 필요합니다.- Luer 밸브 레버로 유동 챔버의 유입을 켭니다.
- 유동 챔버배수를 시작하고 유동 챔버의 범람을 방지하기 위해 유출 펌프에 다음 매개 변수를 보내(도 9):밸브 = 목욕 밸브 (2); 마이크로스텝 모드 = 마이크로; 플런저 대상 = 48,000; 플런저 속도 = 38-40 (임의).
참고: 유체 수준이 항상 안정되어 있는지 확인합니다. myofibril 건조 실행 안 하 고 어느 쪽도 캔틸레버 하지 않아야. 너무 적은 흐름보다 약간의 오버플로를 하는 것이 좋습니다.
- 유동 챔버배수를 시작하고 유동 챔버의 범람을 방지하기 위해 유출 펌프에 다음 매개 변수를 보내(도 9):밸브 = 목욕 밸브 (2); 마이크로스텝 모드 = 마이크로; 플런저 대상 = 48,000; 플런저 속도 = 38-40 (임의).
- Luer 밸브 레버로 유동 챔버의 유입을 켭니다.
- 온도 조절기(그림8, 재료표참조)를 사용하여 원하는 값으로 온도를 설정하려면 원하는 온도를 입력하고'시작'을 누릅니다. 열전 온도 컨트롤러 소프트웨어에서 그래프를 확인하여 원하는 온도에 도달할 때까지 기다렸다가 계속하십시오.
참고: 실온에서 실험을 수행할 때 열전 온도 컨트롤러를 사용할 필요가 없습니다.
4. 실험 프로토콜
- 수행할 활성 힘 프로토콜을 결정합니다.
참고: 연구에 필요한 데이터에 따라 여러 유형의 활성 힘 실험을 수행할 수 있습니다: 단계 4.1.1, 포화시 최대 힘의 측정 [Ca]2+]; 단계 4.1.2, 단계 4.1.1 이외에 칼슘 감도를 결정하기 위해 포스-pCa 곡선을 획득; 단계 4.1.3, 4.1.1 또는 4.1.2 단계 이외에 단축 재스트레칭 프로토콜을 수행하여 장력 재개발의 속도를 결정한다.- 최대 활성 힘을 측정합니다.
- '시작'을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표 참조)에서데이터 기록을시작합니다.
- 데이터 수집 패널이 있는 오픈 밸브 1과 6(재료 표참조) 소프트웨어는 버튼'1+6'을확인하여 이완 솔루션의 유리 Ɵ 흐름을 시작하고 Ɵ 유리(도6A)를통해 용액을 활성화한다.
- 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다(재료 표참조).
- 힘 추적이 안정되면 Ɵ 유리 속기 단계(단계 크기 = 100 μm)를 수행합니다.
신호 발생기 설정은 표 1(그림 5C)에서찾을 수 있습니다. 그림 4D와 유사한 활성화 완화 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어에 기록되고 표시됩니다. - '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어 데이터 기록을 일시 중지합니다.
- 더 이상 활성화가 수행되지 않으면 밸브 1과 6을 닫으면 버튼을 분리하여 Ɵ 유리 흐름을 중지하여'1+6'(그림6B),주사기 펌프를 중지(도 9, 재료의 표참조) 눌러'종료',루어 밸브를 닫음으로써 배경 흐름을 중지합니다.
- 포스-pCa 곡선
참고: 최대 활성 힘을 얻기 위한 4.1.1 단계와 유사하지만 다른 pCa 솔루션을 사용하여 여러 정품 인증이 수행됩니다.- '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
- 데이터 수집 패널 소프트웨어로 밸브 1과 2를 열어 Ɵ 유리를 통해 편안한 솔루션과 pCa 6.2의 흐름을 시작합니다.
- 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
- 힘 추적이 안정되면 Ɵ 유리 속기 단계(단계 크기 = 100 μm)를 수행합니다.
신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다. - '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 일시 중지합니다.
- 밸브 1 및 3 (pCa 5.8), 밸브 1 및 4 (pCa 5.6), 밸브 1 및 5 (pCa 5.4), 밸브 1 및 5 (pCa 5.4), 밸브 1 및 6 (pCa 4.5)용 4.1.2.1-4.1.2.4 단계를 반복하십시오.
- 더 이상 활성화가 수행되지 않으면 밸브 1과 6을 닫으면 버튼을 분리하여 Ɵ 유리 흐름을 중지합니다 '1+6'(그림6A),주사기펌프(그림 9)를누르면'종료'를누르면, 루어 밸브를 닫음으로써 배경 흐름을 중지한다.
- 장력재개발(kTR)의측정 속도.
참고: 최대 활성 력의 경우 4.1.1단계와 유사하지만 일부 변경 및 추가 단계가 있습니다.- 근시브레이15%를 느슨하게 하는 데 필요한 압조 움직임을 계산하고 신호 발생기(도5D, 표 1)에이 값을 입력합니다.
- '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
- 데이터 수집패널(그림 6A)소프트웨어가 있는 오픈 밸브 1과 6은 이완 솔루션의 흐름을 시작하고 pCa 4.5는 Ɵ 유리를 통해 진행한다.
- 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
- 힘 추적이 안정되면 Ɵ 유리 속기 단계(단계 크기 = 100 μm)를 수행합니다.
신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다. - 힘 고원에 도달하면, 압소와 함께 단축 재스트레칭을 수행합니다.
신호 발생기 설정은(그림 5D, 표 1)에서찾을 수 있습니다. 그림 4E와 유사한 활성화 완화 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어에 기록되고 표시됩니다.
참고: 위의 단계를 자동화하기 위해 사용자 지정 프로토콜을 만들 수 있습니다. - '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 일시 중지합니다.
- 더 이상 활성화가 수행되지 않으면 밸브 1과 6을 닫으면 버튼'1+6'(도6B)을선택 해제하여 Ɵ 유리 흐름을 중지하고, 주사기펌프(그림 9)를누르기 위해'종료'를누르고, 루어 밸브를 닫음으로써 배경 흐름을 중지한다.
- 최대 활성 힘을 측정합니다.
- 수동 력 측정을 수행합니다.
- 연속 스트레칭을 수행합니다.
- 근시브릴을 스트레칭하고 신호 발생기(표1)에서이 값을 입력하는 데 필요한 압조 운동을 계산합니다.
참고: 예제 설정입니다. 사컴레 길이에 비해 스트레치의 양과 스트레치 시간을 계산합니다. 이러한 설정은 사컴레당 스트레치 속도가 근시 브릴전체에 동일하게 유지되도록 하는 데 필요합니다. - '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
- 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
- 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 신호 발생기와 함께 연속 스트레칭을 수행하여 압조를 작동시합니다. 예 신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
- 스트레치가 끝난 후 페조로 길이가 느슨해지는 근시브릴을단축(표 1).
- 근시브릴을 스트레칭하고 신호 발생기(표1)에서이 값을 입력하는 데 필요한 압조 운동을 계산합니다.
- 단계별 스트레칭을 수행합니다.
- '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
- 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
- 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 신호 발생기로 단계별 스트레치를 수행하여 압조를 작동시합니다. 예시 신호 생성기 설정은 표 1(그림 5E)에서찾을 수 있습니다.
- 스트레치가 끝난 후 페조와 함께 길이가 느슨해지는 근시브릴을 짧게 합니다. 예 신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
- 연속 스트레칭을 수행합니다.
- '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 일시 중지합니다.
- 시스템 컨트롤러 소프트웨어의'중지'버튼을 눌러 데이터 기록을 중지합니다.
- 시스템 컨트롤러 소프트웨어에'파일'및'저장 데이터'를눌러 데이터를 저장합니다.
5. 청소
- 측정된 마이오미브레이를 제거하고 다음 묘비브릴을 준비하십시오.
- 이렇게하려면 40배의 목표로 안구를 바라보면서 myofibril을 조심스럽게 찢어 버리면 됩니다.
- 힘 프로브와 압전을 위로 이동합니다. Ɵ 유리를 오른쪽으로, 뒤쪽으로 이동합니다. 그런 다음 위로 이동하고 흐름 챔버를 멀리 밀어. 티슈 목욕을 제거합니다.
- 장착 바늘을 청소하려면 10x와 안구를 사용하여 초점을 맞춥니다. 브러쉬를 에탄올에 담그고 조심스럽게 닦고 바늘에서 접착제를 제거합니다.
참고 : 접착제가 벗겨지기까지 시간이 걸릴 수 있음을 명심하십시오. - 유동 챔버와 티슈 목욕을 초순수물로 헹구는 다.
- 프로브를 초순수물로 채워진 작은 페트리 접시에 놓습니다. 프로브가 완전히 잠수되었는지 확인합니다.
- 실험이 완료되면 위와 같이 설정을 정리하고 다음 추가 단계를 수행합니다.
- 흐르는 욕조에서 튜브를 비웁다. 유출 주사기 펌프에 매개 변수를 보냅니다(재료 표, 그림 9참조). 밸브 = 목욕 밸브 (2); 마이크로스텝 모드 = 정상; 플런저 대상 = 0; 플런저 속도 = 30.
참고: 튜브가 비어 있을 때 명령을 종료합니다. - 펌프를 여러 번 초기화합니다(도9B).
- 주사기를 빼내십시오. 이렇게하려면 모든 Luer 밸브를 닫고 모든 밸브를 열고 주사기의 바늘에서 튜브를 제거하고 바늘 아래에 특정 pCa튜브를 잡고 Luer 밸브를 엽니다. 압력 플러그를 사용하여 프로세스 속도를 높일 수 있습니다.
- 튜빙을 주사기바늘에 다시 부착합니다. 주사기를 ~ 5mL의 초순수로 채웁니다. 컵을 Ɵ 유리 아래에 놓습니다. 모든 밸브를 열고 압력 밸브를 열어 시스템을 플러시합니다.
- 시스템을 종료합니다. PC, 간섭계 및 압착 컨트롤러 전원 블록을 끕니다.
- 흐르는 욕조에서 튜브를 비웁다. 유출 주사기 펌프에 매개 변수를 보냅니다(재료 표, 그림 9참조). 밸브 = 목욕 밸브 (2); 마이크로스텝 모드 = 정상; 플런저 대상 = 0; 플런저 속도 = 30.
6. 데이터 분석
- 데이터 파일을 열고 원하는 세그먼트를 선택하여 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표참조)에서 스프레드시트 소프트웨어 프로그램 또는 클립보드로 데이터 추적을 내보냅니다. 표시된 흔적은 내보내집니다(예: 원시 힘, 사코메르 길이 및 압전 위치).
- 선택한 소프트웨어(예: MATLAB)로 분석을 수행합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
데이터 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어로 기록되고 열렸습니다(재료 표참조). 전체 추적 또는 선택한 세그먼트는 원하는 소프트웨어로 추가 분석을 위해 클립보드 또는 텍스트 파일로 내보냈습니다. 다양한 솔루션의 흐름을 제어하는 밸브는 사용자 지정 소프트웨어 또는 수동으로 전환되었습니다. 사용자 지정 MATLAB 스크립트는 활성화 속도 분석하는 데 사용되었습니다, 긴장 재개발, 및 휴식. 수동력 실험의 최대 활성력과 피크 및 고원력은 시스템 컨트롤러 소프트웨어 힘 추적으로부터 직접 촬영하였다. 마이오피브릴(도2)을장착한 후 원하는 프로토콜을 선택했습니다.
최대 활성 력과 칼슘-마우스와 인간의 골격 근육 생검에서 분리 된 근안의 힘의 감도
도 4A에서 활성 힘 실험에 사용되는 실험 용 설정은 스키마테로 묘사된다. 건강한 인간 사두근 근육으로부터 분리된 근시릴을 가진 활성 힘 실험의 힘 흔적이 표시됩니다. myofibril는 다양한 pCa (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; 도 4B에표시된 데이터)를 가진 솔루션으로 5 번 활성화되었습니다. 이 실험에서 모든 myofibrils의 평균 최대 힘은 ~ 123 mN / mm2이었다. 5개의 칼슘 용액각각의 각 활성화 중에 도달한 고원력으로부터 포스-pCa 곡선이 구성되었다. 결과는 그림 4C에표시됩니다. 이 곡선에서 pCa는 최대 힘 생산(pCa50)의 50%로계산하였다. 이 myofibril에서, pCa50이었다 5.75.
또한, 하나 또는 여러 화합물이 myofibril에 의해 생성된 힘에 미치는 영향을 측정하기 위해 퍼퓨즈 된 용액에 첨가될 수 있었다. 도 4D에서,N-벤젤-p-톨루엔 설포나미드(BTS)의 효과는 빠른 트위치 근육(유형 II) 미신 중형체인 II(MHCII) 억제제, 예시된다. 19 A myofibril는 pCa 5.6 용액으로 먼저 활성화되었으며, 그 후 pCa 5.6 + BTS 용액으로 활성화되었습니다. 두 번째 활성화 동안 적은 힘이 생산되었다, 이것은 MHCII를 포함하는 myofibril것을 나타내는. 특정 근육 유형에독점적으로 존재하는 단백질에 있는 돌연변이가 있습니다, 따라서 그 특정 근육 모형에서 myofibrils에 영향을 미칩니다. 이 경우, 근시형의 '타이핑'은 다양한 근육 유형에 대한 돌연변이 효과를 분별하는 것이 중요하다. 또한, 이 예는 myofibrils에서 치료 화합물의 효능을 테스트할 가능성을 보여 준다.
도 4E는 마우스 골격 솔레근육 조직으로부터 분리된 단일 근피릴의 활성 힘 흔적을 나타낸다. 마이오피브릴은 셋업에 장착되어 이완용액(pCa 9.0)으로 인퓨전된 후 활성화 용액(pCa 4.5, ~0.032 mM 칼슘)을 배합하였다. 우리는 동시에 힘과 사카레 길이를 기록했습니다. 이것은 거의 동면 수축이었다, 캔틸레버 편향은 ~ 0.5 μm, 이는 약 이었다 1% myofibril의 느슨한 길이의 (~50 μm). 도 4E에서 급속한 단축 재스트레칭 프로토콜은 장력 재개발(kTR,황색 대시 선)의 속도를 평가하기 위해 활성 수축 중에 수행되었다. kTR은 크로스 브리지 사이클링 운동학의 척도입니다. 또한 활성화 및 이완 곡선은 각각 활성화 속도(kACT,적색 파선) 및 이완(kREL,녹색 파선)을 결정하도록 장착되었다. 도 4는 도 4F에서강조 표시된 이완 단계에 대한 보다 상세한 뷰를 나타낸다. 2단계는 명백해졌다: 1) 초기 의 휴식 단계 (크로스 브리지 분리에 의해 지배) 및 2) 이완의 빠른 단계 (크로스 브리지 분리 및 칼슘 해리에 의해 지배)20.
인간 골격 근육 생검으로부터 분리된 근유릴의 수동력
도 10은 건강한 인간 다이어프램 근육 조직으로부터 분리된 근시릴을 가진 수동력 실험의 흔적을 나타낸다. 첫 번째 프로토콜은 사코레의 점성탄성 특성을 결정하기 위해 하나 또는 여러 패시브 스트레스트를 포함했다. 도 10은 근시릴의 연속 스트레치의 힘 흔적을 나타낸다(사컴 길이 2.2-3.0 μm에서 스트레치). 스트레치 하는 동안, myofibrils 점성 및 탄성 특성을 모두 표시. 이는 도 10A에표시된 곡선에서 분명하게 드러납니다. 날카로운 피크는 두 가지 특성을 모두 나타내는 반면 고원 력은 탄성의 척도입니다. 점도는 변형을 선형으로 저항합니다. 따라서, 스트레인이 제거된 후 힘이 떨어졌다. 도 10B는 스트레치 자체를 강조하고 높은 신호 대 잡음 비율을 보여줍니다. 힘 추적은 필터링되지 않습니다.
그림 1: 골격 근육과 그 형태의 회로도 묘사 및 전자 현미경 이미지. (A)골격 근육의 구조를 나타내고(B)는가장 작은 수축 유닛인 사코머의 구조를 나타낸다. 이러한 회로도 이미지는 세르비에 메디컬 아트(C)로부터 적용되며,(D)근시릴라 손상뿐만 아니라 보존된 근시릴라 초구조체를 드러내는 근육 섬유의 전자 현미경 이미지를 나타낸다.C 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장착된 근시릴, Ɵ 유리 정렬 및 압착 장착 바늘을 보여주는 이미지입니다. (A)40배 의 목표를 통해 볼 수 있는 쉘락으로 코팅된 유리 섬유 바늘 사이에 느슨한 길이로 장착된 마이오피릴. (B)10배 목표를 통해 본 바와 같이 근시릴(흰색 타원형으로 강조 표시)에 비해 Ɵ 유리의 위치의 이미지. (상단) 상단 채널에 정렬 (편안한 솔루션, pCa 9.0); (아래쪽) 하단 채널(활성 용액, pCa 4.5)에 맞추어 근시릴을 칼슘으로 퍼퓨징하고 수축을 유도합니다. (C)근시릴에 비해 Ɵ 유리의 위치의 회로도 묘사. (상단) 상단 채널(편안한 솔루션, pCa 9.0)과 정렬됨; (아래쪽) 하단 채널(활성 용액, pCa 4.5)과 협력하여 myofibril을 칼슘으로 침투시키고 수축을 유도합니다. (D)압전 홀더의 카본로드에 부착된 장착 바늘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 조직 흐름 챔버의 설정 및 끝 부분의 회로도 표현. 진한 파란색으로 알루미늄으로 만든 조직 흐름 챔버, 그리고 흰색으로 힘 프로브와 Ɵ 유리가 위치에 표시되는 캐비티; (센터) 마이오피브릴은 힘 프로브와 압전 길이 모터에 부착된 두 개의 유리 섬유 장착 바늘 사이에 부착되어 있습니다. Ɵ 유리는 근시릴과 정렬됩니다. Ɵ 유리는 위아래로 움직이면 myofibril을 칼슘 용액에 노출시킬 수 있습니다. (오른쪽) 캔틸레버 힘 프로브의 클로즈업. 표시된 캐비티 크기(또는 파브리-페로 캐비티, d); 반사 인터페이스 A, B 및 C; 레이저(red)에 의해 방출되는 광파의 예. 캔틸레버는 비룰의 어깨에 장착됩니다. 간섭계에서 레이저를 운반하는 섬유는 캔틸레버 의 끝에서 비룰을 빠져 나옵니다. 왁스를 사용하여 캔틸레버에 유리 장착 섬유가 고정되어 있습니다. (왼쪽 위) 간섭계는 시스템 컨트롤러 소프트웨어로 전송되는 간섭계 신호를 분석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 활성 장력 실험의 실험 설정 및 데이터입니다. (A)사용되는 관류 설정 및 용액의 회로도 표현. 첫 번째 및 마지막 튜브(라이트 블루)에는 칼슘이 없는 솔루션(예: 편안한 솔루션)이 포함되어 있습니다. (B)인체 골격 근육 조직으로부터 분리된 근막근력 실험의 예형은 이완용액(pCa 9.0)에서 다중 활성화 용액(pCa 6.2 - 4.5)까지 5개의 활성화를 나타낸다. (C)힘 칼슘 곡선; 패널(B)의고원의 힘 수준은 각각의 칼슘 수준에 대해 정규화되고 플롯되었습니다. (D)pCa 5.6 용액(blue)으로 활성화된 인간 골격 근육으로부터 분리된 타입 II(fast twitch) 근시의 예견 추적 및 pCa 5.6 + BTS(타입 II 특이적 크로스브리지 억제제, 빨간색)로 이후이다. (E)활성화 시 급속단축-재스트레칭 프로토콜을 가진 마우스 솔레우스 골격 근육 조직으로부터 분리된 근시골격을 통한 활성 장력 실험의 예데이터 추적(kTR, 황색 파선).TR 또한 활성화 및 이완 곡선은 각각 활성화 속도(kACT,적색 파선) 및 이완(kREL,녹색 파선)을 결정하도록 장착되었다. (F)이완단계(왼쪽 위)의 줌,강조표시(E). 빠른 스텝 모터 신호(왼쪽 아래)는 솔루션이 활성화 솔루션(pCa 4.5)에서 편안한 솔루션(pCa 9.0)으로 변경된 시점을 표시했습니다. 이완 단계는 선형, 느린 위상(오른쪽 위)과 지수, 빠른 위상(오른쪽 아래)으로 구성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 시스템 제어 소프트웨어의 신호 발생기의 예 설정입니다. (재료표참조). 1) 신호 생성기에 입력된 명령을 실행하는 버튼을 나타냅니다. (A)압전 길이 모터를 설정합니다. (B)빠른 스텝 모터 설정. (C)5s의 기간 동안 myofibril을 활성화하는 빠른 단계를 수행(D)kTR을결정하기 위해 myofibril의 급속한 단축 재스트레칭을 수행. (E)점탄성 특성을 결정하기 위해 근시브릴의 단계별 스트레칭을 수행한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PC에서 사용되는 밸브 컨트롤러 소프트웨어. (A)밸브 1(Rx) 및 6(법)을 여는 데 사용되는 버튼입니다. (B)모든 밸브가 닫혀있을 때 버튼의 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 시스템 컨트롤러 소프트웨어로 사컴레 길이, myofibril 길이 및 myofibril 너비 측정. 눈금자를 예로 들 수 있습니다. (A)사카머 길이 측정: 보라색 상자는 근시릴 주위에 배치되고 사카머 길이는 (1)에 도시된다. (B)길이 측정: 시안 상자는 근시릴의 처음부터 끝까지 배치됩니다. (C)측정 폭 : 카메라를 90 °로 회전 한 후, 시안 상자는 myofibril의 한쪽에서 다른 쪽으로 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 열전 온도 컨트롤러 소프트웨어. (A)열전 온도 컨트롤러와의 연결을 설정합니다. (B)온도 설정을 확장합니다. (C)원하는 온도를 설정, 이 경우 : 15 ° C.(D)열전 온도 컨트롤러를 켜고 펠티에 열전 냉각기 모듈에 전압을 보냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 주사기 유출 펌프설정입니다. (A)(1)를 눌러 펌프에 연결을 엽니다. (B)(2)를 눌러 미리 정의된 설정으로 펌프를 시작합니다. (C)'밸브 명령'을'배스밸브'(2)로 설정하고 표시된 대로'명령 세트 매개변수'를입력하여 유출을 시작합니다. (3)를 눌러 명령을 실행합니다. 명령을 눌러 종료할 수 있습니다(4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10: 인간 골격 근육 조직으로부터 분리된 myofibrils를 사용하여 수동 장력 실험의 예 데이터 추적. (A)스트레치 및 방출 프로토콜 동안 힘(upper) 및 사카레 길이(Lower)의 기록. (B)미오비브릴의 스트레치 단계 동안 힘(upper) 및 사코머 길이를 보여주는(A)의줌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 심근세포 칼슘 사전 활성화 실험에서 실험 설정 및 데이터. (A)관류 설정의 회로도 표현. 마지막 튜브(라이트 블루)에는 칼슘이 함유되지 않은 용액(릴렉스 솔루션)이 포함되어 있습니다. (B)각각 1nM 및 80 nM의 칼슘 농도와 함께(연한 파란색) 및 (다크 블루) 칼슘 사전 활성화를 통해 심근세포의 활성화 곡선을 겹쳐낸다. (C)쥐 좌심실으로부터 분리된 야생형(WT)과 이종구스 RBM20(HET) 심근세포에서 칼슘 전불의 비교. 이 그림은 나자피 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | 장치 | 설명 | 모양 | 초기 | ||||||||
| 1.7.1. | Piezo | 초기화 패시브 텐션 | 고정 | 51.6 μm | ||||||||
| 1.7.2. | Piezo | 초기화 활성 장력 | 고정 | 0 μm | ||||||||
| 단계 | 장치 | 설명 | 모양 | 초기 | 지연 | 담당자 | 수준 | 지연 | 수준 | 지연 | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | 빠른 단계 | ɵ 유리 위치 테스트 / myofibril의 활성화 | 펄스 | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 s | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | 빠른 단계 | 마이오피브릴의 활성화 (kTR포함) | 펄스 | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10대 | 4 V | 1 s | ||
| 단계 | 장치 | 설명 | 모양 | 초기 | 지연 | 담당자 | 램프 레벨 | 램프 지속 시간 | 지연 | 램프 레벨 | 램프 지속 시간 | 지연 |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piezo | kTR에 대한 단축 - 다시 스트레칭 | 사다리꼴 | 0 μm | 0.5 s | 1 x | 0 + 0.15 * L0 = __ μm | 0.01 s | 0.01 s | 0 μm | 0.01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piezo | 스트레칭을 계속 | 사다리꼴 | 51.6 μm | 2 s | 1 x | 51.6 - 0.30 * L0 = __ μm | 2 s | 0 s | 51.6 - 0.30 * L0 = __ μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piezo | 미오비브릴을 여유 길이로 되돌리기 | 사다리꼴 | 1.6 μm | 2 s | 1 x | 51.6 μm | 5 s | 0 s | 51.6 μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piezo | 단계별 스트레치 | 사다리꼴 | 51.6 μm | 2 s | 10 x | 51.6 - 5 μm | 0.5 s | 10 s | 51.6 - 5 μm | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | Piezo | 미오비브릴을 여유 길이로 되돌리기 | 사다리꼴 | 1.6 μm | 2 s | 1 x | 51.6 μm | 5 s | 0 s | 51.6 μm | 0 s | 0 s |
표 1: 압전 길이 모터 및 고속 모터를 작동시키기 위해 시스템 컨트롤러 소프트웨어에 사용되는 다양한 신호 발생기 설정을 설명하는 표입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
설명된 것은 인간 또는 동물 골격 근 조직으로부터 분리된 myofibrils의 수축 기능을 평가하는 프로토콜입니다. 이 설정의 힘 해상도는 Chavan 외12에의해 이전에 설명되었습니다. 요컨대, 검출 섬유와 캔틸레버 사이에 형성된 파브리-페로 캐비티의 길이의 임의변동에 의해 결정되며, 이는 판독값(V로 발현됨)의 출력에서 소음의 지배적인 부분을 생성하며, 편향 감도(m/V로 표현)와 캔틸레버의 스프링 상수(N/m로 표현됨)에 의해 배합하여 배분하게하여 잡음(N/m으로 표현됨)을 제공한다. 우리의 설정의 경우, 판독값의 출력시 공기 중의 루트 평균 정사각형(rms) 노이즈는 1,000개의 데이터 포인트/s(샘플/s)로 샘플링되어 약 2mV입니다. 일반적인 myofibril 측정의 경우, ferrule-top 프로브는 ~0.7 N/m의 스프링 상수(편향 감도 300 nm/V)와 함께 사용됩니다. 이 rms 값은 0.6nm의 캔틸레버 편향 해상도에 해당하며, 이는 ~0.37 nN의 힘 감도로 변환됩니다. 힘 프로브는 레코딩레이저(13)의파장의 배수와 동일한 캔틸레버의 굽힘을 유지하면서 계량 스케일에 대한 장착 바늘의 끝을 밀어 보정된다. 이러한 교정 방법은 캔틸레버와 장착 바늘 강성뿐만 아니라 미오피브릴 수축의 속도와 크기로 인한 캔틸레버및 장착 바늘의 토크의 가능한 변화를 수반한다. 현재, 마이오피브릴 수축을 평가하기 위한 설정이 가능하며, 이는 캔틸레버, 즉 광학 빔 편향(1,700 A; ~1 nN 힘 해상도)에서 편향된 레이저의 검출에 기초한다. 이 시스템은 라부다 등에서 개발한 광학 잠망경을 사용하여 레이저 광을 캔틸레버를 방향으로 그리고 멀리 유도하여구성(11)을제한한다. 이 시스템에서는, 마이오비브릴은 원자력 캔틸레버와 단단한 유리 바늘 사이에 장착되어 있습니다. 여기에 설명된 시스템의 장점은 더 높은 힘 감도 및 신호 대 잡음 비율입니다. 더욱이, 이 셋업에서는 상대적으로 딱딱한 캔틸레버를 사용할 수 있으며, 이는 근시릴라 힘이 적용될 때 작은 캔틸레버 편향을 초래한다. 이는 거의 일정한 사컴레 길이의 힘 측정을 허용하므로 중요합니다. 마지막으로, 라부다 등에서 기술한 시스템에 비해, 여기서 시스템은 온도를 조절하고, 근시릴의 길이 변화를 유도하고, Ɵ 유리 및 빠른 단계 모터를 사용하여 관류 용액을 변화시키는 유사하거나 동일한 방법을 활용한다. Labuda 등에서 설명하는 시스템의 장점은 용액 조성(캔틸레버과 광학 잠망경 사이)의 변화가 신호 출력에 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 여기서 설명된 시스템에서는 캔틸레버와 광섬유 사이의 용액 조성이 일정하게 유지되어야 합니다. 이 제한에 대한 해결책은 아래 자세히 설명되어 있습니다.
최적화
빠른 단계 관류 시스템과 결합된 광학 힘 프로브는 합병증으로 이어졌습니다. 저농도 Ca2+ 솔루션 간의 광학 특성의 차이는 힘 측정을 방해합니다. 높은 칼슘 용액의 역류를 방지하기 위해 맞춤형 유량 챔버를 설계하였다(그림3). 칼슘이 없는 용액의 일정한 배경 흐름은 광섬유의 상단과 캔틸레버(도3D)의상부 사이에 용액을 일정하게 유지하기 위해 오른쪽에서 왼쪽으로 유도된다.
온도를 제어하기 위해 액체 냉각이 있는 펠티에 소요소가 유량 챔버에 장착됩니다. 이 흐름 챔버는 플라스틱 어댑터에 장착하여 현미경과 열적으로 분리됩니다. 펠티에 소자를 사용하여 TEC 시스템에 의해 제어되며, 0.1°C 정밀도로 시간이 지남에 따라 용액의 온도를 제어할 수 있다. 온도는 유량 챔버에 장착된 온도 센서에 의해 모니터링됩니다. 온도 안정성은 힘 트랜스듀서의 특성상 중요합니다. 캔틸레버는 금코팅 유리 스트립으로 구성되어 있어 온도계로 효과적으로 제작됩니다. 따라서 캔틸레버는 온도 가변으로 구부러지립니다.
이 설정은 빠른 단계 의 관류 시스템(재료 표참조)을 사용하여 Ɵ 유리의 움직임을 제어합니다. 이 시스템은 10 ms 이내에 관류 스위치를 허용합니다. 온도 제어 및 솔루션 스위칭 방법을 결합하면 이 시스템은 근비릴에서 sarcomere 수축(즉, 힘 개발 속도, 장력 재개발 및 이완)의 운동학을 측정하는 데 특히 적합합니다.
처음에 간섭 측정을 사용하는 단점은 간섭 곡선의 선형 부분을 사용해야 하기 때문에 작은 사용 가능한 범위였다(λ/8, λ와 함께 레이저의 파장). 그러나 최근의 혁신은 파장 변조와 잠금 증폭기를 결합하여 이러한 필요성을 제거했습니다. 따라서 시스템은 간섭 곡선의 단일 선형 부품에 국한되지 않습니다. 이를 통해 캔틸레버14의무한한 편향을 측정할 수 있습니다. 따라서, 이 시스템의 캔틸레버 편향 판독 범위는 기존의 간섭에 비해 크게 확대된다. 또한 설명된 힘 프로브는 교체가 용이하며 0.5 N/m에서 >20 N/m에 이르는 강성과 함께 많은 캔틸레버를 사용할 수 있습니다. 따라서 캔틸레버 간에 빠르게 변경하고 수행된 실험에 가장 적합한 강성을 선택할 수 있다.
도전
현재 시스템은 심근세포 측정 시스템을 기반으로 하는 프로토타입입니다(재료표참조). 더 나은 사용자 경험과 더 높은 품질의 데이터를 제공하기 위해 여러 구성 요소를 개선할 수 있습니다. 첫째, 시스템에 추가 기능으로 인해 진동과 공명이 신호에 소음을 추가하는 문제가 될 수 있습니다. 또한 Ɵ 유리 홀더와 빠른 단계의 모터 부착 방법을 개선하여 진동이 덜 수있도록 할 수 있습니다.
둘째, 용액 스위칭 속도를 높이고 보다 일관된 모션을 얻기 위해 빠른 스텝 모터를 압하 길이 액추에이터로 교체하는 것이 바람직하다.
셋째, 이전에 단일 줄무늬 근육 섬유를 활성화하는 데 사용되었던 칼슘 솔루션에는 프로피온산을 포함하지만 이러한 솔루션은 근적외선을 흡수하여 힘 측정을 방해합니다. 염화칼슘은 프로피오닉산의 필요성을 없애기 위해 사용되었으며, 이로 인해 이 효과가 크게 감소했습니다. 이 문제는 간섭에 기초한 시스템에 내재되며 광학 빔 편향을 활용할 때 존재하지 않습니다.
넷째, 사용자 정의 유동 목욕은 Ɵ 유리의 흐름에 맞게 라미나르 흐름을 생성하도록 설계되었습니다. 이것은 칼슘이 풍부한 용액의 난류로 인한 역류를 방지합니다. 따라서 광섬유의 끝과 캔틸레버 사이의 용액은 일정하게 유지됩니다. 근시릴을 가진 커버슬립은 유동 챔버 하에서 자유롭게 움직일 수 있으므로 적합한 근시릴의 선택은 유동 챔버의 작은 영역에 국한되지 않는다.
재현성 및 가변성
수집된 데이터의 재현성 및 가변성에 중요한 시스템 및 프로토콜에는 여러 요소가 있습니다.
첫째, 측정의 품질은 myofibril 격리의 품질에 크게 좌우됩니다. 동일한 프로토콜은 다른 생검에서 myofibrils의 다른 자질과 양을 산출합니다. 어떤 경우에는 생검이 거의 사용 가능한 근시릴이나 전혀 얻을 수 없습니다. 일반적인 합의는 손상된 myofibrils 수축 하는 동안 휴식 하 고 따라서 결과 설명 되지 않습니다.
둘째, 근시릴의 단면 면적의 결정에 불확실성이 있다. 기술적 제약으로 인해 한 평면에서미오비브릴의 폭을 측정할 수 있습니다. 따라서 단면 영역을 계산하기 위해 너비와 깊이가 동일하다고 가정합니다. 최대 활성 장력을 계산하기 위해 단면 영역으로 힘이 정규화되면 이 가정을 알고 있어야 합니다.
미오피브릴 장착 각도, 위치 및 접착제의 무결성으로 인해 myofibrils장착.
장착 각도와 위치는 주로 시각적으로 제어 할 수 있지만, myofibrils 사이의 작은 변화가 있을 수 있습니다. 접착제 무결성은 광범위하게 조사되지 않았습니다. 그러나, 접착제 무결성은 활성화 전후의 근시브릴에서 사코메르 길이를 모니터링하여 확인할 수 있다. 프로토콜 후 접착제 사이에 더 많은 사코메레스가 있을 때, 이것은 접착제에 있는 myofibril의 미끄러짐이 일어났다는 것을 건의합니다. 따라서 이 myofibril은 데이터 집합에서 제외해야 합니다.
설정의 다른 응용 프로그램: 쥐 왼쪽 심실에서 분리 된 심근 세포에서 칼슘 사전 활성화
myofibrils의 수축 기능을 평가 하는 것 외에도, 시스템은 또한 심근 세포 역학을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 도 11은 쥐 좌심실(21)으로부터 분리된 막-투과성21단일 심근세포의 사용을 도시한다. 위에서 설명한 실험과는 달리, 편안한 용액이 변경되고 용액을 활성화하는 것이 일정하게 유지되었다. 각 심근세포는 5세트의 활성화를 거쳤으며, 1s용 2 μM 무료 칼슘 용액에 노출되었습니다. 1s 시간 제약은 저칼슘 농도 용액이 확장기 상및 높은 칼슘 농도 용액에 노출되어 심장 근육 수축의 수축을 모방하는 심장 수축의 시간 제한 특성을 모방하도록 선택됩니다(그림11A). 5세트 각각의 확장칼슘(1, 80, 160, 250, 400nM 칼슘)은 다양했으며, 수축칼슘은 일정하게 유지되었다(도11A). 세트는 다른 실험 단에 대해 1.8 μm 대 2.0 μm 및 2.0 μm 대 2.2 μm의 세 가지 활성화 완화 주기의 2 세트로 구성되었습니다. 피크 힘은 파이펫의 스위치로부터 1s에서 측정되었고 3개의 활성화-이완 사이클 세트에 대해 평균화되었다. 높은 신호 대 잡이 비율과 이 힘 트랜스듀서의 높은 동적 범위는 확장기 력의 작은 변화와 훨씬 더 큰 수축기힘(도 11B)을모두 측정할 수 있었습니다. 확장칼슘이 증가하면 제1활성화(도 11B)에비해 2μM 칼슘에서 더 높은 힘이 발생하였다. WT 쥐 심근세포는 이종화구우스(HET) RMB20 쥐 심근세포와 비교하였다. 대체 접합로 인해 HET 쥐는 WT 쥐에 비해 더 준수하는 티틴 단백질을 가지고 있습니다. 이 효과는 HET 심근세포에서 80 및 160 μM칼슘(도 11C)에서과장되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
미치엘 헬름스는 IONOptix Inc.의 주주이자 공동 소유주입니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 AFM-텔레톤과 네말린 근종 요법을위한 재단 건물 강도에 의해 지원되었다. 저자는 이 기사에서 언급 된 제품의 제작자를 인정하고자합니다, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C.
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
