JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

ייצור של מגלי גל במצב אפס למיקרוסקופיה של מולקולה בודדת בריכוז גבוה

Published: May 12, 2020
doi:
10.3791/61154
, , , , ,
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Physics,West Chester University

Summary

מתואר כאן שיטת ליטוגרפיה ננוספירה לייצור מקביל של מגלי גל במצב אפס, שהם מערכים של ננו-פטרטורים במיקרוסקופיה זכוכית מצופה מתכת עבור הדמיית מולקולה בודדת בריכוזים ננו-למיקרומולרים של פלואורופורים. השיטה מנצלת את ההרכבה העצמית של הגביש הקולואידי כדי ליצור תבנית מגיד גל.

Abstract

באנזימולוגיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת, פלואורסצנטיות רקע ממצעים מסומנים בתמיסה מגבילה לעתים קרובות את ריכוז הפלורופורים לטווחי פיקו לננומולרים, מספר סדרי גודל פחות מריכוזי ליגנד פיזיולוגיים רבים. ננו-מבנים אופטיים הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), שהם 100−200 ננומטר קוטר צמצמים מפוברקים במתכת מוליכת דקה כגון אלומיניום או זהב, מאפשרים הדמיה של מולקולות בודדות בריכוזים מיקרומולקוליים של פלואורופורים על ידי ההסתה של קטע אור גלוי לנפחים יעילים של זפטוליטר. עם זאת, הצורך בציוד ננו-פיבריות יקר ומתמחה מנע את השימוש הנרחב ב- ZMWs. בדרך כלל, ננו- מבנים כגון ZMWs מתקבלים באמצעות כתיבה ישירה באמצעות ליטוגרפיה של קרן אלקטרונים, שהיא רציפה ואיטית. כאן, קולואידית, או ננוספירה, ליטוגרפיה משמשת כאסטרטגיה חלופית ליצירת מסכות בקנה מידה ננומטר לייצור מדריך גל. דו”ח זה מתאר את הגישה בפירוט, עם שיקולים מעשיים לכל שלב. השיטה מאפשרת אלפי ZMWs אלומיניום או זהב להיעשות במקביל, עם קטרי מדריך גל סופי ומעמקים של 100−200 ננומטר. רק ציוד מעבדה משותף ומאייד תרמי לתצהיר מתכת נדרשים. על ידי הפיכת ZMWs נגיש יותר לקהילה הביוכימית, שיטה זו יכולה להקל על המחקר של תהליכים מולקולריים בריכוזים ובשיעורים הסלולריים.

Introduction

טכניקות של מולקולה אחת כגון העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) או ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של מולקולה אחת (FCS) הן כלים רבי עוצמה לביופיזיקה מולקולרית, המאפשרת לחקור תנועות דינמיות, קונפורמציות ואינטראקציות של ביומולקולות בודדות בתהליכים כגון שעתוק1,2,3, תרגום4,5,6, ורבים אחרים7. עבור smFRET, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת (TIRF) היא שיטה נפוצה מכיוון שניתן לעקוב אחר מולקולות קשורות רבות לאורך זמן, והגל האוונסנטי שנוצר על ידי TIR מוגבל לאזור של 100−200 ננומטר הסמוך לכיסוי8. עם זאת, אפילו עם הגבלה זו על נפח עירור, פלואורופורים של עניין עדיין צריך להיות מדולל לטווחי pM או nM על מנת לזהות אותות מולקולה אחת מעל פלואורקנציה ברקע9. מאז קבועי מיכאליס-מאנטן של אנזימים תאיים הם בדרך כלל בטווח μM כדי mM10, תגובות ביוכימיות במחקרים מולקולה אחת הם בדרך כלל הרבה יותר איטי מאשר אלה בתא. לדוגמה, סינתזת חלבונים מתרחשת ב 15−20 חומצות אמינו לשנייה ב E. coli11,12, בעוד רוב ריבוזומים פרוקריוטים בניסויי smFRET לתרגם ב 0.1−1 חומצת אמינו לשנייה13. בסינתזת חלבונים, מבני קריסטל ו- smFRET על ריבוזומים תקועים הראו כי העברת RNAs (tRNAs) משתנה בין מצבים ‘היברידיים’ ו’קלאסיים ‘ לפני שלב טרנסלוקיציה tRNA-mRNA14,15. עם זאת, כאשר ריכוזים פיזיולוגיים של גורם GTPase טרנסלוקציה, EF-G, היה נוכח, קונפורמציה שונה, ביניים בין המצבים ההיברידיים והקלאסיים, נצפתה smFRET6. חשוב ללמוד תהליכים מולקולריים דינמיים בקצבים ובריכוזים דומים לאלה שבתא, אך נותר אתגר טכני.

אסטרטגיה להגברת ריכוז המצע הפלואורסצנטי היא שימוש בצמצמי אורך גל תת-גלויים מבוססי מתכת, הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), כדי ליצור שדות עירור מוגבלים שמרגשים באופן סלקטיבי ביומולקולים המותאמים לצמחיםבצמצמים 16 (איור 1). הצמצמים הם בדרך כלל 100−200 ננומטר קוטר ו 100−150 ננומטר בעומק17. מעל אורך גל מנותק הקשור לגודל ולצורה של הבארות (λc ≈ פי 2.3 מהקוטר של מגלי גל עגולים עם מים כמדיוםדיאלקטרי 18), אין מצבי הפצה במנזר הגל, ומכאן המונח מגלי גל במצב אפס. עם זאת, שדה אלקטרומגנטי מתנדנד, המכונה גל אוונסנטי, מתפורר באופן אקספוננציאלי בעוצמה עדיין מנהרות מרחק קצר אל מנגוו הגל18,19. למרות שדומה לגלים האוונסטנטים של TIR, לגלים האוונסטנטים של ZMW יש קבוע ריקבון קצר יותר, וכתוצאה מכך אזור עירור יעיל של 10−30 ננומטר בתוך מרוץ הגל. בריכוזים מיקרומולרים של ליגנדים בעלי תווית פלואורסצנטית, רק מולקולה אחת או כמה נמצאות בו זמנית בתוך אזור העירור. הגבלה זו של נפח העירור וכתוצאה מכך הפחתה של פלואורסצנטיות רקע מאפשרת הדמיית פלואורסצנטיות של מולקולות בודדות בריכוזים רלוונטיים ביולוגית. זה יושם על מערכות רבות20, כולל מדידות FCS של דיפוזיה חלבון יחיד21, מדידות FRET מולקולה אחת של חלבון ליגנדזיקה נמוכה 22 וחלבון-חלבון אינטראקציות23, ומדידות ספקטרו-אלקטרוכימיות של אירועי מחזור מולקולרי יחיד24.

ZMWs יוצרו על ידי דפוס ישיר של שכבת מתכת באמצעות כרסום קרן יון25,26 או ליטוגרפיה קרן אלקטרונים (EBL) ואחריו תחריט פלזמה16,27. שיטות ליטוגרפיה נטולות מסכות אלה יוצרות מגלי גל בסדרה ובדרך כלל דורשות גישה למתקני ננו-פיבריות מיוחדים, ומונעות אימוץ נרחב של טכנולוגיית ZMW. שיטה נוספת, הרמת ליטוגרפיה ננו-הדפסה אולטרה סגולה28, משתמשת בתבנית שקופית קוורץ כדי ללחוץ על תבנית ZMW הפוכה על סרט התנגדות כמו בול. בעוד שיטה זו היא יעילה יותר, זה עדיין דורש EBL לייצור של עובש קוורץ. מאמר זה מציג את הפרוטוקול עבור שיטת ייצור תבנית פשוטה וזולה שאינה דורשת כרסום EBL או קרן יונים ומבוססת על אריזה קרובה של ננוספירות ליצירת מסכה ליטוגרפית.

ננוספירה או ליטוגרפיה “טבעית”, שהוצעה לראשונה בשנת 1982 על ידי דקמן ודנסמויר29,30, משתמשת בהרכבה עצמית של חלקיקים קולואידיים חד-דיספרזה, החל מעשרות ננומטרים ועד עשרות מיקרומטרים31, כדי ליצור תבניות לדפוס פני השטח באמצעות תחריט ו / או תצהיר של חומרים. מערכים תקופתיים דו-ממדיים (2D) או תלת-ממדיים (3D) של חלקיקים קולואידיים, המכונים גבישים קולואידיים, מאופיינים בססגוניות בהירה מפיזור ועקיפה32. למרות שנעשה שימוש נרחב פחות מקרן אלקטרונים או פוטוליתוגרפיה, מתודולוגיית מיסוך זו היא פשוטה, בעלות נמוכה, ומצטמצמת בקלות כדי ליצור גדלי תכונות מתחת ל- 100 ננומטר.

מכוון ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואידיים קובע את ההצלחה של שימוש בגבישים קולואידיים כמסכות לדפוס פני השטח. אם הגודל והצורה של חלקיקים הם הומוגניים, חלקיקים קולואידיים יכולים להיות מורכבים בקלות עם אריזה משושה, מונע על ידי דלדול אנטרופי33. אידוי מים לאחר ציפוי טיפה הוא מסלול יעיל למשקע חלקיקי הקולואידים, אם כי שיטות אחרות כוללות ציפוימטבל 34, ציפוי ספין35, תצהיר אלקטרופורטי36, ואיחוד בממשק מי אוויר37. הפרוטוקול המוצג להלן מבוסס על שיטת משקעים אידוי, אשר היה הפשוט ביותר ליישם. האינטרסטיקים המשולשים בין חרוזי פוליסטירן ארוזים היטב יוצרים פתחים שבהם ניתן לטלטל מתכת הקרבה, ויוצרים עמדות(איור 2 ואיור משלים 1). חישול קצר של החרוזים לפני שלב זה מתאים את הצורה ואת הקוטר של פוסטים אלה. החרוזים מוסרים, שכבת מתכת סופית מופקדה סביב העמודים, ואז הפוסטים מוסרים. לאחר שני צעדי התצהיר המתכתיים אל ננו-מסכת הננו-מולקולה הקולואידית, הסרת עמדות הביניים ושינוי הכימיה על פני השטח עבור פסיבציה וקשירה, מערכי ZMW מוכנים לשימוש להדמיית מולקולה אחת. אפיון נרחב יותר של המאפיינים האופטיים ZMW לאחר ייצור ניתן למצוא במאמר נלווה38. מלבד מאייד תרמי לתצהיר אדים של המתכות, אין צורך בכלים מיוחדים.

Protocol

הערה: ניתן להשלים את כל השלבים בשטח המעבדה הכללי. 1. ניקוי כיסוי זכוכית כדי לספק משטח נקי לתצהיר אידוי של חלקיקים קולואידיים, מניחים כיסויי זכוכית בורוסיליקט אופטיים 24 x 30 מ”מ (0.16−0.19 מ”מ) בתוך התוספות המחורצות של צנצנת ויטראז’ים של זכוכית קופלין לניקוי.הערה: ודאו שהכיסו…

Representative Results

ההרכבה העצמית של חלקיקי הקולואידים הפוליסטירן באמצעות משקעים אידויים (שלבים 2.1−2.13) יכולה לייצר מגוון תוצאות שכן היא דורשת שליטה על קצב אידוי הממס. עם זאת, מכיוון שהתצהירים מהירים (10−15 דקות לסיבוב), ניתן אופטימיזציה מהירה של ההליך לתנאי מעבדת סביבה שונים. איור 3A מציג תבנית ?…

Discussion

עבור ההרכבה העצמית הקולואידית (פרוטוקול סעיף 2), השימוש באתנול ולא במים כמו ממס ההשעיה מאיץ את תהליך האידוי כך שהתבניות מוכנות תוך 2−3 דקות לאחר התצהיר ולא 1−2 שעות כמו בשיטות קודמות48,49. פרוטוקול משקעים אידוי המוצג כאן הוא גם פשוט יותר מאשר פרוטוקולי משקעים ק?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01GM080376, R35GM118139, ומרכז NSF להנדסה MechanoBiology CMMI: 15-48571 ל- Y.E.G., ועל ידי מלגת NIAID טרום דוקטורט NRSA F30AI114187 ל R.M.J.

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A ‘pocket guide’ to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. . Electromagnetism. , (2002).
  19. Jackson, J. D. . Classical electrodynamics. Third edition. , (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v. Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

Zero Mode WaveguidesSingle Molecule MicroscopyNanosphere LithographyEvaporative DepositionPolystyrene BeadsHumidity ChamberOptical Borosilicate Glass CoverslipsAcetonePotassium HydroxideEthanolCentrifugationRelative Humidity

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image