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Bioingegneria

고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조

Published: May 12, 2020
doi:
10.3791/61154
, , , , ,
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Physics,West Chester University

Summary

여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

Abstract

단일 분자 형광 효소학에서, 용액에 표지된 기판에서 배경 형광은 수시로 피코- 나노 몰라 범위에 형광포 농도를 제한하고, 많은 생리적인 리간드 농도 보다는 크기의 몇몇 순서. 알루미늄이나 금과 같은 얇은 전도 금속으로 제작된 직경 100-200 nm의 제로 모드 도파관(ZMWs)이라고 불리는 광학 나노 구조는 가시광선 내분을 제프토리터 유효 볼륨에 국한하여 형광 농도의 미세 모름 농도에서 개별 분자의 이미징을 허용합니다. 그러나, 고가의 특수 나노 제조 장비에 대한 필요성은 ZMWs의 광범위한 사용을 배제하고있다. 여기서, 콜로이드, 또는 나노권, 리소그래피는 와도파 제작을 위한 나노미터 규모의 마스크를 만드는 대안 전략으로 이용됩니다. 이 보고서는 각 단계에 대한 실질적인 고려 사항과 함께 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 방법을 통해 수천 개의 알루미늄 또는 골드 ZMW를 병렬로 만들 수 있으며 최종 파도어 직경과 깊이는 100-200 nm입니다. 금속 증착을 위한 일반적인 실험실 장비와 열 증발기만 필요합니다. ZMWs가 생화학 적 커뮤니티에 더 쉽게 접근 할 수 있도록함으로써,이 방법은 세포 농도 및 비율에 분자 과정의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

Introduction

단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 또는 단일 분자 형광 상관 분광법(FCS)과 같은 단일 분자 기술은 분자 생물물리학을 위한 강력한 도구로,전사1,2,3,번역4,5,6,기타 7, 기타 7과 같은 공정에서 개별 생체 분자의 동적 움직임, 적합성 및 상호 작용의 연구를 가능하게한다. smFRET의 경우, 많은 테더드 분자가 시간이 지남에 따라 추적될 수 있기 때문에 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사는 일반적인 방법이며, TIR에 의해 생성된 에반센드 파는 커버슬립8에인접한 100-200 nm 영역으로 제한된다. 그러나, 이러한 포주 부피에 대한 제한에도 불구하고, 배경 형광9위의 단일 분자 신호를 검출하기 위해서는 여전히 pM 또는 nM 범위로 희석되어야 한다. 세포 효소의 Michaelis-Menten 상수는 전형적으로 mM 범위10에μM에 있기 때문에, 단일 분자 연구에서 생화확적인 반응은 일반적으로 세포에 있는 것보다 훨씬 느립니다. 예를 들어, 단백질 합성은 대장균11,12에서초당 15-20 아미노산에서 발생하며, 대부분의 대장균 리보솜은 스모트 실험에서 초당 0.1-1아미노산으로 변환된다 13. 단백질 합성에서, 정체된 리보좀에 대한 결정 구조 및 smFRET는 tRNA-mRNA 전좌 단계14,15이전에 ‘하이브리드’와 ‘고전적인’ 상태 사이에서 전송 RNA(tRNAs)가 변동하는 것으로 나타났다. 그러나, 전좌 GTPase 인자, EF-G의 생리적 농도가 존재했을 때, 하이브리드와 고전 국가 사이의 상이한 형태, 중간, smFRET6에서관찰되었다. 세포에 있는 것과 유사한 비율 그리고 농도에 동적 분자 프로세스를 공부하는 것은 중요합니다, 그러나 기술적인 도전남아 있습니다.

형광 기판 농도를 증가시키는 전략은 제로 모드 파도어(ZMWs)라고 불리는 금속 계의 가시파장 조리개를 사용하여 조리개 내에서 국소화된 생체 분자를 선택적으로 자극하는 제한된 흥분 장을 생성하는 것이다(그림1). 조리개는 일반적으로 직경 100-200 nm, 깊이17에서100-150 nm입니다. 우물의 크기 및 형상과 관련된 컷오프 파장(λc≈ 유전체매체(18)로물을 가진 원형 도파관의 직경은 2.3배≈) 전파 모드가 도파관에 허용되지 않으므로, 따라서 용어 제로 모드 파도가이드. 그러나 진동하는 전자기장은 에반센드 파라고 불리는, 강도가 기하급수적으로 부패하면서도파선(18,19)으로짧은 거리를 터널링한다. TIR 에반센센트 파도와 유사하지만, ZMW 에반센센트 파도는 부패 상수를 가지며, 그 결과 도파관 내에서 10-30 nm 유효 여기 영역이 생성됩니다. 형광 으로 표지된 리간드의 미세 몰라 농도에서, 단지 하나 또는 몇몇 분자는 흥분 지역 안에 동시에 존재합니다. 흥분 부피의 이 제한 및 배경 형광의 결과적인 감소는 생물학으로 관련있는 농도에서 단 하나 분자의 형광 화상 진찰을 가능하게 합니다. 이는 단일 단백질확산(21)의FCS 측정, 저친화성 리간드단백질(22)및 단백질 단백질상호작용(23)의 단일 분자 FRET 측정, 단일 분자 회전율이벤트(24)의분광-전기화학적 측정을 포함한 많은 시스템에 적용되었다.

ZMW는 이온 빔 밀링25,26 또는 전자 빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 금속 층을 직접 패터닝한 다음 플라즈마 에칭16,27로생산되었다. 이러한 마스크리스소그래피 방법은 일련의 파관을 생성하고 일반적으로 ZMW 기술의 광범위한 채택을 방지하여 특수 나노 제조 시설에 대한 액세스가 필요합니다. 또 다른 방법, 자외선 나노 임프린트 리소그래피 리프트 오프(28)는석영 슬라이드 금형을 사용하여 스탬프와 같은 저항 필름에 역 ZMW 템플릿을 누릅니다. 이 방법은 더 간소화되어 있지만 석영 금형을 제작하기 위해서는 EBL이 필요합니다. 이 문서에서는 EBL 또는 이온 빔 밀링을 필요로 하지 않으며 소각 마스크를 형성하기 위해 나노스피어의 밀착 포장을 기반으로 하는 간단하고 저렴한 템플릿 제작 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

1982년 Deckman과 Dunsmuir29,30에의해 처음 제안된 나노스피어 또는 “천연” 리소그래피는 수십 나노미터에서 수십 마이크로미터31에이르는 모노분산 콜로이드 입자의 자체 조립을 사용하여 에칭 및/또는 재료의 증착을 통한 표면 패터닝을 위한 템플릿을 만듭니다. 콜로이드 결정이라고 불리는 콜로이드 입자의 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 확장된 주기적인 배열은 산란 및배절(32)으로부터의밝은 무지개빛 물질을 특징으로 한다. 전자 빔이나 포토리스그래피보다 덜 널리 사용되지만 이 마스킹 방법론은 간단하고 저렴한 비용으로 쉽게 축소되어 100 nm 미만의 피처 크기를 만듭니다.

콜로이드 입자의 자체 조립을 지시하는 것은 곡성 결정을 표면 패터닝을 위한 마스크로 사용하는 성공을 결정합니다. 입자의 크기와 모양이 균일한 경우, 콜로이드 입자는 엔트로피고갈기(33)에 의해 구동되는 육각형포장으로 쉽게 자체 조립될 수 있다. 낙하 코팅 후 의 수분 증발은 콜로이드 입자를 침전하는 효과적인 경로이지만, 다른 방법은 딥 코팅(34,스핀 코팅35,전기 지질 증착36)및 공기 물 인터페이스(37)에서통합을 포함한다. 아래에 제시된 프로토콜은 가장 간단한 증발 침전 방법을 기반으로 합니다. 삼각형은 희생 금속을 플레이트하는 개구부를 형성하여 구멍을 형성하는 개구부를 형성한다(그림2 및 보충 도 1). 이 단계 전에 구슬의 간략한 어닐링은 이러한 게시물의 모양과 직경을 조정합니다. 구슬이 제거되고 최종 금속 층이 게시물 주위에 증착된 다음 게시물이 제거됩니다. 콜로이드 나노 마스크에 두 개의 금속 증착 단계 후, 중간 기둥의 제거, 통과 및 테더링을위한 표면 화학 수정, ZMW 어레이는 단일 분자 이미징에 사용할 준비가되어 있습니다. 제조 후 ZMW 광학 특성의 보다 광범위한 특성화는 함께 제공되는 제38에서찾을 수 있다. 금속의 증기 증착을 위한 열 증발기 외에 특수 공구가 필요하지 않습니다.

Protocol

참고: 모든 단계는 일반 실험실 공간에서 완료할 수 있습니다. 1. 유리 커버 슬립 청소 콜로이드 입자의 증발 증착을 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위해 24 x 30mm 광학 보로실리케이트 유리 커버립(0.16-0.19 mm 두께)을 세척용 코플린 유리 스테닝 항아리의 홈 인서트 내에 배치합니다.참고: 커버립이 똑바로 서 있고 잘 분리되어 있는지 확인하여 청소 과정에서 모든 표면?…

Representative Results

증발 침전(steps 2.1−2.13)을 통한 폴리스티렌 콜로이드 입자의 자체 조립은 용매 증발속도를 제어해야 하기 때문에 다양한 결과를 생성할 수 있다. 그러나 기탁이 빠르기 때문에(라운드당 10-15분), 절차는 다양한 주변 실험실 조건에 맞게 신속하게 최적화될 수 있습니다. 도 3A증착 및 증발 후 잘 형성된 콜로이드 템플릿을 나타낸다. 매크로, 구슬의 영역은 원형, 비드의 불투명?…

Discussion

콜로이드 자체 조립(프로토콜 섹션 2)의 경우, 서스펜션 용매가 증발 공정을 가속화함에 따라 물 대신 에탄올을 사용하여 이전방법(48,49)과마찬가지로 1-2h가 아닌 증착 후 2-3분 안에 템플릿을 준비한다. 여기에 제시된 증발 침전 프로토콜은 또한서스펜션(49,50,51)의표면 기울기, 온도 및 공기 ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH 보조금 R01GM080376, R35GM118139 및 NSF 엔지니어링 메카노생물학 CMMI 센터: 15-48571에서 Y.E.G.에, 그리고 NIAID 전 박사 NRSA 펠로우십 F30AI114187에서 Rj.j..M.

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.
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Riferimenti

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Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).
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