高濃度単一分子顕微鏡のためのゼロモード導波ガイドの作製

Summary

ここでは、フルオロフォアのナノからミクロモル濃度で単分子イメージングのための金属張りのガラス顕微鏡カバースリップにおけるナノパーチャーの配列であるゼロモードの導波管の平行作製のためのナノスフィアリソグラフィー法を説明する。この方法は、コロイド結晶自己集合を利用して導波管テンプレートを作成します。

Abstract

単一分子蛍光エンミノロジーでは、溶液中の標識基質からのバックグラウンド蛍光は、多くの生理学的リガンド濃度よりも数桁少ない数桁のピコからナノモルの範囲に蛍光を制限することが多い。アルミニウムや金などの薄い導電金属で作られた直径100~200nmの直径開口であるゼロモード導波管(ZMWs)と呼ばれる光学ナノ構造は、可視光励起をゼプトリットル有効体積に限定することで、蛍光色素のマイクロモル濃度で個々の分子をイメージングすることができます。しかし、高価で特殊なナノファブリケーション装置の必要性は、ZMWsの広範な使用を妨げている。典型的には、ZMWsのようなナノ構造は、逐次的かつ遅い電子ビームリソグラフィを用いて直接書くことによって得られる。ここで、コロイド、またはナノスフィアは、導波路製作のためのナノメートルスケールマスクを作成する代替戦略として用いられる。このレポートでは、各フェーズの実際的な考慮事項と共に、アプローチについて詳しく説明します。この方法により、数千のアルミニウムまたはゴールドのZMWを並列に作成でき、最終的な導波管の直径と深さは100〜200nmです。金属蒸着用の一般的なラボ機器と熱蒸発器のみが必要です。生化学的コミュニティにZMWsをよりアクセスしやすくすることで、この方法は細胞の濃度と速度での分子プロセスの研究を容易にすることができます。

Introduction

単一分子蛍光共鳴エネルギー伝達(smFRET)や単分子蛍光相関分光(FCS)などの単一分子技術は、分子生物物理学のための強力なツールであり、転写^1、2、3、翻訳^4、6などのプロセスにおける個々の生体分子の動的動き、立体構造、相互作用の研究を可能にする^7。smFRETの場合、多くのテザード分子が経つ場合があり、TIRによって発生するエバネッセント波はカバースリップ⁸に隣接する100-200 nm領域に制限されるため、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は一般的な方法である。しかし、励起体積に関するこの制限があっても、背景蛍光⁹を超える単一分子シグナルを検出するためには、関心のある蛍光体をpMまたはnM範囲に希釈する必要がある。細胞酵素のミカエル-メンテン定数は、典型的にはμMからmM範囲¹⁰であるため、単一分子研究における生化学的反応は、通常、細胞内の反応よりもはるかに遅い。例えば、タンパク質合成は大腸菌^11,12において1秒当たり15~20アミノ酸で起こり^、smFRET実験における原核生物リボソームの大部分^は、毎秒0.1~1アミノ酸で翻訳される。タンパク質合成において、失速リボソーム上の結晶構造およびsmFRETは、tRNA-mRNA転座ステップ^14,15の前に「ハイブリッド」状態と「古典的」状態の間でRNA(tRNA)の転移が変動することを示した。しかし、転座GTPase因子の生理的濃度が、EF−G、存在した場合、異なる立体構造、ハイブリッド状態と古典状態との中間体が、smFRET6で観察された。細胞内と同様の速度と濃度で動的分子プロセスを研究することは重要ですが、技術的な課題は残っています。

蛍光基質濃度を高める戦略は、ゼロモード導波ガイド(ZMWs)と呼ばれる金属ベースのサブ可視波長開口を用いて、開口¹⁶内に局在する生体分子を選択的に励起する限定励起場を生成することである(図1)。開口部は通常、直径 100~200 nm、深さ¹⁷で 100~150 nm です。ウェルの大きさと形状に関連するカットオフ波長(λ_c≈、水を有する円形導管の直径の2.3倍の誘電媒体^18)、導波路では伝播モードが認められません。しかし、振動電磁場は、エバネッセント波と呼ば、指数関数的に強度が減衰し、依然として導波管^18,19に短い距離をトンネルする。TIRエバネッセント波と同様に、ZMWエバネッセント波は減衰定数が短く、導波路内で10〜30nm有効な励起領域を生じます。蛍光標識リガンドのマイクロモル濃度では、励起領域内に同時に存在する分子は1個または数個に過ぎない。この励起体積の制限とそれに伴うバックグラウンド蛍光の減少により、生物学的に関連する濃度で単一分子の蛍光イメージングが可能になります。これは、多くのシステム²⁰に適用されているが、単一タンパク質拡散²¹のFCS測定、低親和性リガンドタンパク質²²およびタンパク質タンパク質相互作用²³の単一分子FRET測定、および単一分子ターンオーバーイベント²⁴の分光電気化学的測定を含む。

ZMWsは、イオンビームミリング^{25、26または}電子ビームリソグラフィ(EBL)を用いて金属層を直接パターン化し、続いてプラズマエッチング^16、27を生成した。これらのマスクレスリソグラフィ法は、一連の導波ガイドを作成し、通常、ZMW技術の普及を防ぐために、特殊なナノファブリケーション施設へのアクセスを必要とします。もう一つの方法は、紫外線ナノインプリントリソグラフィーリフトオフ^28、切手のようなレジストフィルムに逆ZMWテンプレートを押し込むために石英スライド型を使用する。この方法はより合理化されていますが、石英金型の製造にはEBLが必要です。本稿では、EBLやイオンビームミリングを必要とせず、リソグラフィマスクを形成するためにナノスフィアの密閉に基づく、シンプルで安価なテンプレート化された製造方法のプロトコルを紹介します。

1982年にDeckmanとDunsmuir^29,30によって最初に提案されたナノスフィアまたは「天然」リソグラフィーは、数十ナノメートルから数十マイクロメートル³¹までの単分散コロイド粒子の自己集合体を使用して、エッチングおよび/または材料の堆積を介した表面パターニングのテンプレートを作成します。2次元(2D)または3次元(3D)コロイド粒子の拡張周期配列は、コロイド結晶と呼ばれ、散乱および回折³²からの明るい虹彩を特徴とする。電子ビームやフォトリソグラフィよりも広く使用されていないが、このマスキング方法論は、シンプルで低コストで、100nm以下の特徴サイズを作成するために簡単に縮小されます。

コロイド粒子の自己集合性を導き、表面パターニング用のマスクとしてコロイド結晶を使用することの成功を決定します。粒子の大きさと形状が均質であれば、コロイド粒子は、六角形のパッキングで容易に自己組み立てすることができ、エントロピー枯渇³³によって駆動される。滴下後の水蒸発はコロイド粒子を沈降させる有効な経路であるが、他の方法としては、ディップコート^34、スピンコート^35、電気泳動堆積^36、空気水界面³⁷での定着が挙げられる。以下に示すプロトコルは、最も簡単に実装された蒸発堆積物法に基づいています。密梱されたポリスチレンビーズ間の三角形の間間に、犠牲金属をプレートする開口部を形成し、ポストを形成する(図2 および 補足図1)。このステップの前にビーズの短いアニーリングは、これらのポストの形状と直径を調整します。ビーズが除去され、最終的な金属層がポストの周りに堆積し、ポストが削除されます。コロイドナノマスクへの2つの金属蒸着ステップ、中間ポストの除去、およびパッシベーションおよびテザリングのための表面化学修飾の後、ZMWアレイは単一分子イメージングに使用する準備ができています。製造後のZMW光学特性のより広範な特性は、添付の記事³⁸で見つけることができます。金属の蒸着のための熱蒸発器のほかに、特別な用具は要求されない。

Protocol

注: すべての手順は、一般的なラボスペースで完了できます。 1. ガラスカバースリップクリーニング コロイド粒子の蒸発堆積のためのきれいな表面を提供するために、24 x 30 mmの光学ホウケイ酸ガラスカバーリップ(0.16-0.19 mm厚さ)を、コプリンガラス染色瓶の溝付きインサート内に配置して洗浄します。注: クリーニングプロセス中にすべての表面がはっきりと?…

Representative Results

蒸発沈着によるポリスチレンコロイド粒子の自己集合性(ステップ2.1−2.13)は、溶媒蒸発速度の制御を必要とするため、さまざまな結果を生み出すことができます。ただし、堆積は速いため(ラウンドあたり10〜15分)、手順は異なる環境実験室の条件に対して迅速に最適化することができます。 図3A は、蒸着および蒸発後の整形コロイドテンプレートを示す。マクロ的には…

Discussion

コロイド自己集合(プロトコルセクション2)では、懸濁溶媒として水ではなくエタノールを使用すると、以前の方法^48,49のように、テンプレートが1−2時間ではなく、堆積後2〜3分で準備ができるように、蒸発プロセスを高速化する。ここで提示される蒸発沈積分プロトコルは、サスペンション^{49、50、51<…}

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.