Het meten van de samenvloeiing van iPSC's met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem.
Summary
Het doel van het protocol is om verschillende extracellulaire matrix (ECM) coatingcondities te vergelijken om te beoordelen hoe differentiële coating de groeisnelheid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) beïnvloedt. In het bijzonder streven we ernaar om voorwaarden te creëren om een optimale groei van iPSC-culturen te verkrijgen.
Abstract
Deze studie richt zich op het begrijpen hoe het kweken van iPSC’s op verschillende ECM-coatingsubstraten de celconfluentie kan beïnvloeden. Er is een protocol opgesteld om iPSC-samenvloeiing in realtime te beoordelen zonder dat cellen in eencellige suspensie hoeven te worden geteld om groeiverstoring te voorkomen. Een high-content beeldanalysesysteem werd gebruikt om de samenvloeiing van iPCS op 4 verschillende ECM’s in de loop van de tijd op een geautomatiseerde manier te beoordelen. Verschillende analyse-instellingen werden gebruikt om de celconfluentie van adherente iPSC’s te beoordelen en slechts een klein verschil (na 24 en 48 uur met laminine) is waargenomen of een 60, 80 of 100% masker werd toegepast. We laten ook zien dat laminine leidt tot de beste samenvloeiing in vergelijking met Matrigel, vitronectine en fibronectine.
Introduction
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) worden verkregen uit somatische cellen en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen. Ze worden vaak gebruikt als een systeem om ziektepathogenese te modelleren of geneesmiddelenscreening uit te voeren, en bieden ook het potentieel om te worden gebruikt in de context van gepersonaliseerde geneeskunde. Aangezien iPSC’s een groot potentieel hebben, is het belangrijk om ze volledig te karakteriseren voor gebruik als een betrouwbaar modelsysteem. We toonden eerder het belang aan van het kweken van iPSC’s in een hypoxische omgeving, omdat deze cellen afhankelijk zijn van glycolyse en een aerobe omgeving redox-onbalans kan veroorzaken1. iPSC’s zijn ook kwetsbaar voor andere kweekomstandigheden, met name de extracellulaire omgeving. Optimalisatie van cultuuromstandigheden is een belangrijk probleem om ze gezond en proliferatief te houden. Een gezonde iPSC-cultuur zal leiden tot gezonde gedifferentieerde cellen die over het algemeen het eindpunt zijn van het model dat wordt gebruikt om moleculaire, cellulaire en functionele kenmerken van specifieke menselijke aandoeningen of cellulaire processen te begrijpen.
In deze studie is een eenvoudig protocol gebruikt om de samenvloeiing van iPSC’s te testen met behulp van verschillende coatingcondities in afzonderlijke putten. iPSC’s hebben een feederlaag van murine embryonale fibroblasten (MEF) nodig om zich goed te hechten, maar de coëxistentie van iPSC’s en MEF maakt het moeilijk om analyses zoals RNA of eiwitextractie uit te voeren, omdat er twee populaties cellen aanwezig zijn. Om de feederlaag te vermijden, zijn verschillende eiwitten die behoren tot de extracellulaire matrix (ECM) gebruikt om de natuurlijke celniche te recreëren en om feedervrije iPSC-cultuur te hebben. In het bijzonder is Matrigel een opgelost keldermembraanpreparaat geëxtraheerd uit het Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizensarcoom, dat is verrijkt met extracellulaire matrixeiwitten (d.w.z. laminine, collageen IV, heparansulfaatproteoglycanen, entactine / nidogeen en groeifactoren)2,3. De andere gebruikte coatingcondities zijn in plaats daarvan gezuiverde eiwitten met bekende relevantie bij het bouwen van de ECM’s: laminine-521 is bekend dat het wordt uitgescheiden door menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) in de binnenste celmassa van het embryo en het is een van de meest voorkomende lamininen in het lichaam na de geboorte 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronectine is een xenovrije celkweekmatrix waarvan bekend is dat het de groei en differentiatie van hPSC 12,13,14,15,16 ondersteunt; fibronectine is een ECM-eiwit dat belangrijk is voor de ontwikkeling van gewervelde dieren en de aanhechting en het onderhoud van embryonale stamcellen in een pluripotente toestand 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Omdat er verschillende coatingcondities beschikbaar zijn, vergelijken we ze in termen van hun effect op de samenvloeiing van iPSC’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van iPSC’s voor ziektemodellering en toekomstige geneesmiddelenscreening, samen met hun mogelijke toepassing in precisiegeneeskunde, maakt het een technologie van groot belang en om deze reden zijn wij van mening dat het noodzakelijk is om de in vitro kweekconditie duidelijk te begrijpen die beter lijkt op de fysiologische situatie van embryonale stamcellen. In deze context hebben we verschillende ECM-coatings getest met behulp van wild type iPSC’s om de omstandigheden te begrijpen die de cellen in staat stel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd ondersteund door subsidies van de Fondazione Bambino Gesù en Ricerca Corrente (Italiaans ministerie van Volksgezondheid) aan C.C. We willen graag Dr. Enrico Bertini (Afdeling Neurowetenschappen, Eenheid Neuromusculaire en Neurodegeneratieve Ziekten, Laboratorium voor Moleculaire Geneeskunde, Bambino Gesù Children’s Research Hospital), Dr Stefania Petrini (Confocale Microscopie Core Facility, Onderzoekslaboratoria, Bambino Gesù Children’s Research Hospital), Giulia Pericoli (Afdeling Onco-hematologie, Gen- en Celtherapie, Kinderonderzoeksziekenhuis Bambino Gesù) bedanken. en Roberta Ferretti (afdeling Onco-hematologie, Gen- en Celtherapie, Children’s Research Hospital Bambino Gesù) voor wetenschappelijke discussies en technische hulp. Maria Vinci is ontvanger van een “Children with Cancer UK fellowship”.
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
Riferimenti
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochimica. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochimica. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
