Misurazione della confluenza di iPSC utilizzando un sistema di imaging automatizzato.
Summary
L’obiettivo del protocollo è confrontare diverse condizioni di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) per valutare in che modo il rivestimento differenziale influisce sul tasso di crescita delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). In particolare, miriamo a creare le condizioni per ottenere una crescita ottimale delle colture iPSC.
Abstract
Questo studio si concentra sulla comprensione di come la crescita di iPSC su diversi substrati di rivestimento ECM può influenzare la confluenza cellulare. È stato stabilito un protocollo per valutare la confluenza di iPSC in tempo reale senza la necessità di contare le cellule in sospensione monocellulare per evitare qualsiasi perturbazione della crescita. Un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto è stato utilizzato per valutare la confluenza di iPCS su 4 diversi ECM nel tempo in modo automatizzato. Sono state utilizzate diverse impostazioni di analisi per valutare la confluenza cellulare di iPSC aderenti e solo una leggera differenza (a 24 e 48 ore con laminina) è stata osservata se è stata applicata una maschera al 60, 80 o 100%. Mostriamo anche che la laminina porta alla migliore confluenza rispetto a Matrigel, vitronectin e fibronectina.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono ottenute da cellule somatiche e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule. Sono spesso utilizzati come sistema per modellare la patogenesi della malattia o eseguire lo screening dei farmaci e offrono anche il potenziale per essere utilizzati nel contesto della medicina personalizzata. Poiché le iPSC hanno un grande potenziale, è importante caratterizzarle completamente per l’uso come sistema modello affidabile. In precedenza abbiamo dimostrato l’importanza della crescita di iPSC in un ambiente ipossico poiché queste cellule si basano sulla glicolisi e un ambiente aerobico può causare uno squilibrio redox1. Le iPSC sono anche vulnerabili ad altre condizioni di coltura, in particolare all’ambiente extracellulare. L’ottimizzazione delle condizioni colturali è una questione chiave per mantenerle sane e proliferanti. Una coltura iPSC sana porterà a cellule differenziate sane che generalmente sono l’endpoint del modello utilizzato per comprendere le caratteristiche molecolari, cellulari e funzionali di specifici disturbi umani o processi cellulari.
In questo studio, è stato utilizzato un semplice protocollo per testare la confluenza di iPSC utilizzando diverse condizioni di rivestimento in pozzetti separati. Le iPSC richiedono uno strato di alimentazione di fibroblasti embrionali murini (MEF) per attaccarsi correttamente, ma la coesistenza di iPSC e MEF rende difficile eseguire analisi come l’estrazione di RNA o proteine poiché sono presenti due popolazioni di cellule. Al fine di evitare lo strato di alimentazione, diverse proteine appartenenti alla matrice extracellulare (ECM) sono state utilizzate per ricreare la nicchia cellulare naturale e per avere una coltura di iPSC priva di alimentatore. In particolare, Matrigel è un preparato di membrana basale solubilizzato estratto dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), arricchito in proteine della matrice extracellulare (laminina, collagene IV, eparan solfato proteoglicani, entactin/nidogeno e fattori di crescita)2,3. Le altre condizioni di rivestimento utilizzate sono invece proteine purificate con rilevanza nota nella costruzione delle ECM: la laminina-521 è nota per essere secreta dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nella massa cellulare interna dell’embrione ed è una delle laminine più comuni nell’organismo dopo la nascita 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina è una matrice di coltura cellulare xeno-free nota per supportare la crescita e la differenziazione di hPSC 12,13,14,15,16; la fibronectina è una proteina ECM importante per lo sviluppo dei vertebrati e l’attaccamento e il mantenimento delle cellule staminali embrionali in uno stato pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Poiché sono disponibili diverse condizioni di rivestimento, le confrontiamo in termini di effetto sulla confluenza delle iPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilizzo delle iPSC per la modellizzazione delle malattie e il futuro screening farmacologico insieme alla loro possibile applicazione in medicina di precisione la rende una tecnologia di grande rilevanza e per questo motivo riteniamo che sia necessario comprendere chiaramente la condizione di coltura in vitro che meglio assomiglia alla situazione fisiologica delle cellule staminali embrionali. In questo contesto, abbiamo testato diversi rivestimenti ECM utilizzando iPSC wild type al fine di comprendere le condizioni c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente a C.C. Si ringraziano il Dott. Enrico Bertini (Dipartimento di Neuroscienze, Unità di Malattie Neuromuscolari e Neurodegenerative, Laboratorio di Medicina Molecolare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), la Dott.ssa Stefania Petrini (Centro di Microscopia Confocale, Laboratori di Ricerca, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale di Ricerca Pediatrica Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù) per le discussioni scientifiche e l’assistenza tecnica. Maria Vinci è destinataria di una borsa di studio “Children with Cancer UK”.
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
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