Измерение слияния иПСК с помощью автоматизированной системы визуализации.
Summary
Целью протокола является сравнение различных условий покрытия внеклеточного матрикса (ECM) для оценки того, как дифференциальное покрытие влияет на скорость роста индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). В частности, мы стремимся создать условия для получения оптимального роста культур iPSC.
Abstract
Это исследование фокусируется на понимании того, как выращивание IPSC на различных подложках покрытия ECM может повлиять на слияние клеток. Протокол для оценки слияния iPSC в режиме реального времени был создан без необходимости подсчета клеток в одноклеточной суспензии, чтобы избежать любого возмущения роста. Система анализа изображений с высоким содержанием использовалась для автоматизированной оценки слияния iPCS на 4 различных ECM с течением времени. Для оценки слияния клеток адгезивных ИПСК использовались различные параметры анализа, и наблюдалась лишь небольшая разница (через 24 и 48 часов с ламинином), независимо от того, применялась ли маска 60, 80 или 100%. Мы также показываем, что ламинин приводит к лучшему слиянию по сравнению с Матригелем, витронектином и фибронектином.
Introduction
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) получают из соматических клеток и могут быть дифференцированы в различные типы клеток. Они часто используются в качестве системы для моделирования патогенеза заболеваний или проведения скрининга лекарств, а также предлагают потенциал для использования в контексте персонализированной медицины. Поскольку iPSC обладают большим потенциалом, важно полностью охарактеризовать их для использования в качестве надежной модельной системы. Ранее мы показали важность выращивания иПСК в гипоксической среде, поскольку эти клетки полагаются на гликолиз, а аэробная среда может вызвать окислительно-восстановительный дисбаланс1. ИПСК также уязвимы к другим условиям культивирования, особенно к внеклеточной среде. Оптимизация условий культуры является ключевым вопросом для поддержания их здоровья и распространения. Здоровая культура iPSC приведет к здоровым дифференцированным клеткам, которые обычно являются конечной точкой модели, используемой для понимания молекулярных, клеточных и функциональных особенностей конкретных расстройств человека или клеточных процессов.
В этом исследовании был использован простой протокол для проверки слияния иПСК с использованием различных условий покрытия в отдельных скважинах. IPSCs требуют питательного слоя мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) для правильного присоединения, но сосуществование iPSCs и MEF затрудняет выполнение анализа, такого как РНК или экстракция белка, поскольку присутствуют две популяции клеток. Чтобы избежать фидерного слоя, различные белки, принадлежащие к внеклеточному матриксу (ECM), были использованы для воссоздания естественной клеточной ниши и создания культуры iPSC без фидера. В частности, Матригель представляет собой солюбилизированный препарат базальной мембраны, извлеченный из саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (EHS), который обогащен белками внеклеточного матрикса (т.е. ламинином, коллагеном IV, протеогликанами сульфата гепарана, энтактином/нидогеном и факторами роста)2,3. Другими используемыми условиями покрытия вместо этого являются очищенные белки, имеющие известное значение при построении ECM: ламинин-521, как известно, секретируется человеческими плюрипотентными стволовыми клетками (hPSCs) во внутренней клеточной массе эмбриона, и это один из наиболее распространенных ламининов в организме после рождения 4,5,6,7,8,9, 10,11; витронектин представляет собой матрицу клеточной культуры без ксено, которая, как известно, поддерживает рост и дифференцировку hPSC 12,13,14,15,16; фибронектин является белком ECM, важным для развития позвоночных и прикрепления и поддержания эмбриональных стволовых клеток в плюрипотентном состоянии 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Поскольку доступны различные условия покрытия, мы сравниваем их с точки зрения их влияния на слияние иПСК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование ИПСК для моделирования заболеваний и будущего скрининга лекарств вместе с их возможным применением в прецизионной медицине делает ее технологией большой актуальности, и по этой причине мы считаем, что необходимо четко понимать условия культивирования in vitro, которые луч?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано грантами Фонда Бамбино Джезу и Ricerca Corrente (Министерство здравоохранения Италии) C.C. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Энрико Бертини (Отделение неврологии, Отделение нервно-мышечных и нейродегенеративных заболеваний, Лаборатория молекулярной медицины, Детская исследовательская больница Бамбино Джезу), д-ра Стефанию Петрини (Конфокальная микроскопическая основная установка, Исследовательские лаборатории, Детская исследовательская больница Bambino Gesù), Джулию Периколи (Отделение онкогематологии, генной и клеточной терапии, Детская исследовательская больница Bambino Gesù) и Роберта Ферретти (отделение онкогематологии, генной и клеточной терапии, Детская исследовательская больница Бамбино Джезу) для научных дискуссий и технической помощи. Мария Винчи является получателем стипендии «Дети с раком в Великобритании».
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
Riferimenti
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochimica. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochimica. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
