एक स्वचालित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके आईपीएससी के संगम को मापना।
Summary
प्रोटोकॉल का लक्ष्य विभिन्न बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोटिंग स्थितियों की तुलना करना है ताकि यह आकलन किया जा सके कि विभेदक कोटिंग प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) की वृद्धि दर को कैसे प्रभावित करती है। विशेष रूप से, हम आईपीएससी संस्कृतियों के इष्टतम विकास को प्राप्त करने के लिए स्थितियां स्थापित करने का लक्ष्य रखते हैं।
Abstract
यह अध्ययन यह समझने पर केंद्रित है कि विभिन्न ईसीएम कोटिंग सब्सट्रेट्स पर बढ़ते आईपीएससी सेल संगम को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। वास्तविक समय में आईपीएससी संगम का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है, जिसमें किसी भी विकास गड़बड़ी से बचने के लिए एकल सेल निलंबन में कोशिकाओं की गणना करने की आवश्यकता नहीं है। स्वचालित तरीके से समय के साथ 4 अलग-अलग ईसीएम पर आईपीसीएस संगम का आकलन करने के लिए एक उच्च-सामग्री छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग किया गया था। अनुयायी आईपीएससी के सेल संगम का आकलन करने के लिए विभिन्न विश्लेषण सेटिंग्स का उपयोग किया गया था और केवल एक मामूली अंतर (लैमिनिन के साथ 24 और 48 घंटे पर) देखा गया है कि क्या 60, 80 या 100% मास्क लगाया गया था। हम यह भी दिखाते हैं कि लैमिनिन मैट्रिगेल, विट्रोनेक्टिन और फाइब्रोनेक्टिन की तुलना में सबसे अच्छा संगम का कारण बनता है।
Introduction
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) दैहिक कोशिकाओं से प्राप्त किए जाते हैं और उन्हें विभिन्न सेल प्रकारों में विभेदित किया जा सकता है। वे अक्सर रोग रोगजनन को मॉडल करने या दवा स्क्रीनिंग करने के लिए एक प्रणाली के रूप में उपयोग किए जाते हैं, और व्यक्तिगत चिकित्सा के संदर्भ में उपयोग किए जाने की क्षमता भी प्रदान करते हैं। चूंकि आईपीएससी में बड़ी क्षमता है, इसलिए एक विश्वसनीय मॉडल प्रणाली के रूप में उपयोग के लिए उन्हें पूरी तरह से चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। हमने पहले हाइपोक्सिक वातावरण में बढ़ते आईपीएससी के महत्व को दिखाया था क्योंकि ये कोशिकाएं ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करती हैं और एक एरोबिक वातावरण रेडॉक्स असंतुलन का कारण बन सकताहै। आईपीएससी अन्य संस्कृति स्थितियों, विशेष रूप से बाह्य वातावरण के प्रति भी संवेदनशील हैं। संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन उन्हें स्वस्थ रखने और प्रसार करने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। एक स्वस्थ आईपीएससी संस्कृति स्वस्थ विभेदित कोशिकाओं को जन्म देगी जो आम तौर पर विशिष्ट मानव विकारों या सेलुलर प्रक्रियाओं की आणविक, सेलुलर और कार्यात्मक विशेषताओं को समझने के लिए उपयोग किए जाने वाले मॉडल का समापन बिंदु हैं।
इस अध्ययन में, अलग-अलग कुओं में विभिन्न कोटिंग स्थितियों का उपयोग करके आईपीएससी के संगम का परीक्षण करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है। आईपीएससी को ठीक से संलग्न करने के लिए मुराइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) की फीडर परत की आवश्यकता होती है, लेकिन आईपीएससी और एमईएफ के सह-अस्तित्व से आरएनए या प्रोटीन निष्कर्षण जैसे विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है क्योंकि कोशिकाओं की दो आबादी मौजूद होती है। फीडर परत से बचने के लिए, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से संबंधित विभिन्न प्रोटीनों का उपयोग प्राकृतिक सेल आला को फिर से बनाने और फीडर मुक्त आईपीएससी संस्कृति के लिए किया गया है। विशेष रूप से, मैट्रिगेल एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म (ईएचएस) माउस सारकोमा से निकाला गया एक घुलनशील तहखाने झिल्ली तैयारी है, जो बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन (यानी, लैमिनिन, कोलेजन IV, हेपरन सल्फेट प्रोटीओग्लाइकेन्स, एंटैक्टिन / निडोजन, और विकास कारकों) में समृद्ध है। अन्य उपयोग की जाने वाली कोटिंग स्थितियां ईसीएम के निर्माण में ज्ञात प्रासंगिकता के साथ शुद्ध प्रोटीन हैं: लैमिनिन -521 को भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचपीएससी) द्वारा स्रावित किया जाता है और यह जन्म के बाद शरीर में सबसे आम लैमिनिन में से एक है 4,5,6,7,8,9, 10,11; विट्रोनेक्टिन एक क्सीन-मुक्त सेल कल्चर मैट्रिक्स है जो एचपीएससी 12,13,14,15,16 के विकास और भेदभाव का समर्थन करने के लिए जाना जाता है; फाइब्रोनेक्टिन एक ईसीएम प्रोटीन है जो कशेरुक विकास और प्लुरिपोटेंट अवस्था 17,18,19,20,21,22,23,24,25 में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लगाव और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि विभिन्न कोटिंग स्थितियां उपलब्ध हैं, इसलिए हम आईपीएससी के संगम पर उनके प्रभाव के संदर्भ में उनकी तुलना करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोग मॉडलिंग और भविष्य की दवा स्क्रीनिंग के लिए आईपीएससी का उपयोग सटीक चिकित्सा में उनके संभावित अनुप्रयोग के साथ मिलकर इसे बहुत प्रासंगिकता की तकनीक बनाता है और इस कारण से हम मानते हैं कि इन विट्रो सं?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन को फोंडाज़ियोन बाम्बिनो गेसो और राइसर्का कोरेन्टे (इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय) से सीसी को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम डॉ एनरिको बर्टिनी (न्यूरोसाइंस विभाग, न्यूरोमस्कुलर और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की इकाई, आणविक चिकित्सा प्रयोगशाला, बैम्बिनो गेसो चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल), डॉ स्टेफानिया पेट्रिनी (कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, अनुसंधान प्रयोगशालाएं, बैम्बिनो गेसो चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल), गिउलिया पेरिकोली (ऑन्को-हेमेटोलॉजी विभाग, जीन और सेल थेरेपी विभाग, बच्चों के अनुसंधान अस्पताल बैम्बिनो गेसो) को धन्यवाद देना चाहते हैं। और रॉबर्टा फेरेटी (ऑन्को-हेमेटोलॉजी, जीन और सेल थेरेपी विभाग, बच्चों के अनुसंधान अस्पताल बैम्बिनो गेसो) वैज्ञानिक चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए। मारिया विंची “कैंसर यूके फैलोशिप के साथ बच्चों” की प्राप्तकर्ता हैं।
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
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