Mätning av sammanflödet av iPSC med hjälp av ett automatiserat bildsystem.
Summary
Målet med protokollet är att jämföra olika extracellulära matrisbeläggningsförhållanden (ECM) för att bedöma hur differentiell beläggning påverkar tillväxthastigheten för inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). I synnerhet strävar vi efter att skapa förutsättningar för att uppnå optimal tillväxt av iPSC-kulturer.
Abstract
Denna studie fokuserar på att förstå hur växande iPSC på olika ECM-beläggningssubstrat kan påverka cellsammanflödet. Ett protokoll för att bedöma iPSC-sammanflöde i realtid har upprättats utan att celler behöver räknas i encellssuspension för att undvika tillväxtstörningar. Ett bildanalyssystem med hög innehåll användes för att bedöma iPCS-sammanflödet på 4 olika ECM över tid på ett automatiserat sätt. Olika analysinställningar användes för att bedöma cellsammanflödet av vidhäftande iPSC och endast en liten skillnad (vid 24 och 48 timmar med laminin) har observerats om en 60, 80 eller 100% mask applicerades. Vi visar också att laminin leder till det bästa sammanflödet jämfört med Matrigel, vitronektin och fibronektin.
Introduction
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) erhålls från somatiska celler och kan differentieras till olika celltyper. De används ofta som ett system för att modellera sjukdomspatogenes eller utföra läkemedelsscreening och erbjuder också potential att användas i samband med personlig medicin. Eftersom iPSC har stor potential är det viktigt att fullt ut karakterisera dem för användning som ett pålitligt modellsystem. Vi har tidigare visat vikten av att odla iPSC i en hypoxisk miljö eftersom dessa celler är beroende av glykolys och en aerob miljö kan orsaka redoxobalans1. iPSC är också sårbara för andra odlingsförhållanden, särskilt den extracellulära miljön. Optimering av odlingsförhållanden är en nyckelfråga för att hålla dem friska och spridande. En hälsosam iPSC-odling kommer att leda till friska differentierade celler som i allmänhet är slutpunkten för modellen som används för att förstå molekylära, cellulära och funktionella egenskaper hos specifika mänskliga störningar eller cellulära processer.
I denna studie har ett enkelt protokoll använts för att testa sammanflödet av iPSC med olika beläggningsförhållanden i separata brunnar. iPSC kräver ett matarskikt av murina embryonala fibroblaster (MEF) för att fästa ordentligt, men samexistensen mellan iPSC och MEF gör det svårt att utföra analyser som RNA eller proteinextraktion eftersom två populationer av celler är närvarande. För att undvika matarskiktet har olika proteiner som tillhör den extracellulära matrisen (ECM) använts för att återskapa den naturliga cellnischen och för att ha matarfri iPSC-kultur. I synnerhet är Matrigel ett solubiliserat källarmembranpreparat extraherat från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mussarkom, som berikas i extracellulära matrisproteiner (dvs laminin, kollagen IV, heparansulfatproteoglykaner, entaktin / nidogen och tillväxtfaktorer)2,3. De andra använda beläggningsförhållandena är istället renade proteiner med känd relevans för att bygga ECM: laminin-521 är känt för att utsöndras av humana pluripotenta stamceller (hPSC) i embryots inre cellmassa och det är en av de vanligaste lamininerna i kroppen efter födseln 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin är en xenofri cellodlingsmatris som är känd för att stödja tillväxt och differentiering av hPSC 12,13,14,15,16; fibronektin är ett ECM-protein som är viktigt för ryggradsdjurens utveckling och bindning och underhåll av embryonala stamceller i ett pluripotent tillstånd 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Eftersom olika beläggningsförhållanden är tillgängliga jämför vi dem när det gäller deras effekt på iPSC: s sammanflöde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av iPSC för sjukdomsmodellering och framtida läkemedelsscreening tillsammans med deras möjliga tillämpning inom precisionsmedicin gör det till en teknik av stor relevans och av denna anledning anser vi att det är nödvändigt att tydligt förstå in vitro-odlingstillståndet som bättre liknar den fysiologiska situationen för embryonala stamceller. I detta sammanhang testade vi olika ECM-beläggningar med iPSC av vild typ för att förstå de förhållanden som gör att cellerna kan förbli i ett hä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av bidrag från Fondazione Bambino Gesù och Ricerca Corrente (italienska hälsoministeriet) till C.C. Vi vill tacka Dr Enrico Bertini (Institutionen för neurovetenskap, Enheten för neuromuskulära och neurodegenerativa sjukdomar, Laboratoriet för molekylär medicin, Bambino Gesù Children’s Research Hospital), Dr Stefania Petrini (Confocal Microscopy Core Facility, Research Laboratories, Bambino Gesù Children’s Research Hospital), Giulia Pericoli (Institutionen för onko-hematologi, gen- och cellterapi, Children’s Research Hospital Bambino Gesù) och Roberta Ferretti (Institutionen för onko-hematologi, gen- och cellterapi, Children’s Research Hospital Bambino Gesù) för vetenskapliga diskussioner och teknisk hjälp. Maria Vinci är mottagare av ett “Children with Cancer UK fellowship”.
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
Riferimenti
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochimica. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochimica. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
