أتمتة قياسات المجهر القوة الحيوية الذرية على مئات من خلايا ألبيكانس C.
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى أتمتة قياسات AFM على مئات الخلايا الميكروبية. أولا، يتم شل حركة الميكروبات في الهياكل المجهرية لختم PDMS ومن ثم يتم إجراء قياسات التحليل الطيفي بالقوة تلقائيا على مئات الخلايا المشلودة.
Abstract
تهدف الطريقة المعروضة في هذه الورقة إلى أتمتة تجارب Bio-AFM وتسجيل منحنيات القوة. باستخدام هذه الطريقة، فمن الممكن لتسجيل المنحنيات القوات على 1000 خلية في 4 ساعات تلقائيا. للحفاظ على وقت تحليل 4 ساعات، يتم تقليل عدد منحنيات القوة لكل خلية إلى 9 أو 16. الأسلوب يجمع بين برنامج Jython القائم على واستراتيجية لتجميع الخلايا على أنماط محددة. البرنامج، الذي تم تنفيذه على بيو-AFM التجارية، يمكن أن مركز تلميح على الخلية الأولى من الصفيف ومن ثم التحرك، تلقائيا، من خلية إلى خلية أثناء تسجيل منحنيات القوة على كل خلية. باستخدام هذه المنهجية ، من الممكن الوصول إلى المعلمات الفيزيائية الحيوية للخلايا مثل صلابتها ، وخصائصها اللاصقة ، وما إلى ذلك. مع التشغيل الآلي وعدد كبير من الخلايا تحليلها، يمكن للمرء الوصول إلى سلوك السكان الخلية. وهذا إنجاز كبير في مجال بيو-أ إف إم حيث تم تسجيل البيانات، حتى الآن، على بضع عشرات فقط من الخلايا.
Introduction
يوفر هذا العمل منهجية لإجراء قياسات القوة التلقائية على مئات الخلايا الحية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). كما يوفر طريقة لشل حركة الميكروبات على طابع PDMS المجهري المتوافق مع تجارب AFM التي أجريت في بيئة سائلة.
Bio-AFM هي تقنية متخصصة للغاية تم تصميمها للتطبيقات في علم الأحياء ثم تستخدم لدراسة الخلايا الحية. يتطلب مهندسا مدربا يمكنه تحليل خلية واحدة في ذلك الوقت. في هذه الظروف، يكون عدد الخلايا المختلفة التي يمكن تحليلها صغيرا نوعا ما، نموذجيا من 5 إلى 10 خلايا في 4-5 ساعات. ومع ذلك، فإن كمية قياسات القوة المسجلة على خلية واحدة عادة ما تكون عالية جدا ويمكن أن تصل بسهولة إلى 1000. وبالتالي ، فإن النموذج الحالي لقياسات قوة AFM على الخلايا الحية هو تسجيل مئات منحنيات القوة (FCs) ولكن على عدد محدود من الخلايا.
ومن الناحية الإحصائية، فإن هذا النهج مشكوك فيه ويثير مسألة تمثيل العينة. في الواقع، من الصعب، على سبيل المثال، تقييم عدم التجانس بين مجموعة الخلايا من خلال قياس عدد قليل من الخلايا فقط، حتى لو تم تسجيل مئات القياسات على هذه الخلايا القليلة. ومع ذلك ، على أساس هذا النموذج الذي تم إحراز تقدم كبير في الفيزياء الحيوية وعلم الأحياء المجهرية والطب النانوي1و2و3. في الواقع ، قدم تحليل نانومتر على نطاق خلايا واحدة معلومات جديدة عن الميكانيكا النانوية الخلوية ، على تنظيم البروتينات عبر الميمبران ، أو آلية عمل الأدوية المضادة للميكروبات أو مضادات الميكروبات4،5،6،7. ولكن في الآونة الأخيرة، ظهرت العديد من الاختبارات الميكانيكية الحيوية عالية الإنتاجية التي أجريت على الخلايا8،مما يدل على اهتمام المجتمع العلمي في تغيير هذا النموذج والوصول إلى عدم التجانس السكاني الخلية. تعتمد جميع هذه الاختبارات على أنظمة microfluidic لتشوه الخلايا وقياس تشوهها بصريا تحت الضغط للحصول على مقياس غير مباشر لمرونتها السطحية الإجمالية8. ومع ذلك ، فإن مشكلة مهمة مع هذه الأساليب هي أنها أحادية البارامترية: يمكن فحص مرونة الخلية فقط. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تسمح بقياس المعلمات الميكانيكية للخلايا الملتصقة، والتي يمكن أن تحد من دراسات خلايا الثدييات غير الدورانية أو الأغشية الحيوية على سبيل المثال.
وقد تم تطوير النهج التي تنطوي على AFM من قبل فرق S. Scheuring9 و M. Favre10. Scheuring وآخرون الخلايا المشلولة على أنماط فيبروكتين9, إجبار الخلايا الفردية على اتخاذ شكل نمط9. ثم قام هذا الفريق بتعيين الخصائص الميكانيكية لعدد قليل من الخلايا لتحديد متوسط البيانات ، ممثل 14 إلى 18 خلية. ويهدف التطوير الذي قام به Farve وآخرون إلى مضاعفة القياسات من خلال التوازي مع AFM cantilevers10. على حد علمنا، هذا العمل في الاتجاه المتعدد لم يؤد إلى قياسات على الخلايا الحية.
يقدم النهج المثير للاهتمام الذي اقترحه فريق دوجاردين AFM آليا قادرا على تحديد الخلايا وتصويرها في الجزء السفلي من الآبار المصنوعة خصيصا. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تسمح لتحليل عدد كبير من الخلايا، فإنه يسمح للاختبار التلقائي لظروف مختلفة في كل بئر11.
هدفنا في هذا العمل هو أكثر طموحا لأننا أردنا قياس ما لا يقل عن 1000 خلية للوصول ليس إلى خلية متوسطة ، ولكن ، على العكس من ذلك ، عدم التجانس بين الخلايا. تستند الاستراتيجية التي وضعناها هنا للوصول إلى عدم تجانس سكان الخلايا باستخدام AFM إلى تحليل مئات الخلايا التي يتم تسجيل عدد محدود من منحنيات القوة عليها. وبالمقارنة مع النهج “التقليدي” المتمثل في تسجيل عدد كبير من منحنيات القوة على عدد محدود من الخلايا، ينبغي اعتبار هذا النهج مكملا لأنه لا يقدم نفس المعلومات. في الواقع ، في حين أن الطريقة النموذجية تسمح للمرء بالتحقيق في عدم التجانس سطح الخلية الفردية ، وذلك باستخدام نهجنا ، ونحن قادرون على الوصول إلى عدم التجانس مجموع سكان الخلية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بدمج طريقة تعمل مباشرة على شل حركة الميكروبات (هنا أنواع الخميرة المبيضات البيض)في آبار الطابع المجهريPDMS 12، وتطور برنامجا أصليا لنقل طرف AFM ، تلقائيا ، من الخلية إلى الخلية13 وقياس الخصائص الميكانيكية لكل خلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
والتحسن الرئيسي الذي توفره هذه المنهجية هو زيادة كبيرة في عدد الخلايا المقاسة في فترة زمنية محددة. النظير هو تخفيض عدد النقاط التي تقاس لكل خلية. وهذا يعني أن هذه الطريقة ليست مصممة لتقديم تحليل مفصل لخلية واحدة. تنطبق الطريقة فقط على الخلايا التي يمكن أن تتلاءم مع آبار ختم PDMS. الطابع هو تن?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نريد أن نعترف FONCYCYT من كوناسيت (المكسيك) ، ووزارة الخارجية الفرنسية وجامعة باريس 13 ، على الرغم من الدعم المالي للمشروع التعاوني الدولي ECOS – NORD اسمه نانو الجس للتشخيص ، رقم 263337 (المكسيك) وMI5P02 (فرنسا). ويود المكتب أن يشكر الدعم المالي الذي تقدمه الشبكة من خلال المشروع رقم 20195489. ويدعم SPC من قبل زمالة دكتوراه من كوناسيت (رقم 288029) و IPN من خلال اتفاق كوتيل للحصول على شهادة دكتوراه مزدوجة (IPN-UPS). ED وCFD هم باحثون في المركز الوطني للبحوث Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Riferimenti
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
