Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen
Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, AFM-Messungen an Hunderten von mikrobiellen Zellen zu automatisieren. Zuerst werden Mikroben in PDMS-Stempelmikrostrukturen immobilisiert und dann werden kraftspektroskopische Messungen automatisch an Hunderten von immobilisierten Zellen durchgeführt.
Abstract
Die in diesem Artikel vorgestellte Methode zielt darauf ab, Bio-AFM-Experimente und die Aufzeichnung von Kraftkurven zu automatisieren. Mit dieser Methode ist es möglich, Kräftekurven auf 1000 Zellen in 4 Stunden automatisch aufzuzeichnen. Um eine Analysezeit von 4 Stunden einzuhalten, wird die Anzahl der Kraftkurven pro Zelle auf 9 oder 16 reduziert. Die Methode kombiniert ein Jython-basiertes Programm und eine Strategie zum Zusammensetzen von Zellen auf definierten Mustern. Das Programm, das auf einem kommerziellen Bio-AFM implementiert ist, kann die Spitze auf der ersten Zelle des Arrays zentrieren und sich dann automatisch von Zelle zu Zelle bewegen, während Kraftkurven auf jeder Zelle aufgezeichnet werden. Mit dieser Methodik ist es möglich, auf die biophysikalischen Parameter der Zellen wie ihre Steifigkeit, ihre Hafteigenschaften usw. zuzugreifen. Mit der Automatisierung und der großen Anzahl der analysierten Zellen kann man auf das Verhalten der Zellpopulation zugreifen. Dies ist ein Durchbruch im Bio-AFM-Bereich, wo bisher nur Daten an wenigen Dutzend Zellen aufgezeichnet wurden.
Introduction
Diese Arbeit bietet eine Methodik, um automatische Kraftmessungen an Hunderten von lebenden Zellen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) durchzuführen. Es bietet auch eine Methode zur Immobilisierung von Mikroben auf einem mikrostrukturierten PDMS-Stempel, die mit AFM-Experimenten kompatibel ist, die in einer flüssigen Umgebung durchgeführt werden.
Bio-AFM ist eine hochspezialisierte Technologie, die für Anwendungen in der Biologie konzipiert und dann zur Untersuchung lebender Zellen verwendet wird. Es erfordert einen ausgebildeten Ingenieur, der eine Zelle zu diesem Zeitpunkt analysieren kann. Unter diesen Bedingungen ist die Anzahl der verschiedenen Zellen, die analysiert werden können, eher klein, typische 5 bis 10 Zellen in 4-5 Stunden. Die Menge der an einer einzelnen Zelle aufgezeichneten Kraftmessungen ist jedoch in der Regel sehr hoch und kann leicht 1000 erreichen. Daher besteht das derzeitige Paradigma der AFM-Kraftmessungen an lebenden Zellen darin, Hunderte von Kraftkurven (FCs) aufzuzeichnen, jedoch auf einer begrenzten Anzahl von Zellen.
Statistisch gesehen ist dieser Ansatz fragwürdig und wirft die Frage nach der Repräsentativität der Stichprobe auf. Tatsächlich ist es beispielsweise schwierig, die Heterogenität einer Zellpopulation zu bewerten, indem man nur wenige Zellen misst, selbst wenn hunderte von Messungen an diesen wenigen Zellen aufgezeichnet werden. Auf der Grundlage dieses Paradigmas wurden jedoch große Fortschritte in der Biophysik, Mikrobiologie und Nanomedizin erzielt1,2,3. Tatsächlich hat die Nanometeranalyse auf der Skala einzelner Zellen neue Informationen über die zelluläre Nanomechanik, über die Organisation von Transmembranproteinen oder den Wirkmechanismus antimikrobieller oder krebshemmender Medikamente geliefert4,5,6,7. In jüngster Zeit sind jedoch mehrere biomechanische Hochdurchsatztests an Zellen aufgetaucht8, die das Interesse der wissenschaftlichen Gemeinschaft zeigen, dieses Paradigma zu ändern und auf die Heterogenität der Zellpopulation zuzugreifen. Diese Tests basieren alle auf mikrofluidischen Systemen, um Zellen zu verformen und ihre Verformung unter Belastung optisch zu messen, um ein indirektes Maß für ihre gesamte Oberflächenelastizität zu erhalten8. Ein wichtiges Problem bei diesen Methoden ist jedoch, dass sie monoparametrisch sind: Nur die Zellelastizität kann untersucht werden. Darüber hinaus erlauben sie keine Messung der mechanischen Parameter von adhärenten Zellen, was beispielsweise für die Untersuchung von nicht zirkulierenden Säugetierzellen oder Biofilmen einschränkend sein kann.
Ansätze mit AFM wurden von den Teams von S. Scheuring9 und M. Favre10entwickelt. Scheuring et al. immobilisierten Zellen auf Fibronektinmustern9, die einzelne Zellen zwangen, die Form des Musters anzunehmen9. Dann kartierte dieses Team die mechanischen Eigenschaften einiger Zellen, um durchschnittliche Daten zu definieren, die für 14 bis 18 Zellen repräsentativ sind. Die von Farve et al. durchgeführte Entwicklung zielte darauf ab, die Messungen durch Parallelisierung der AFM-Ausleger10 zumultiplexen. Unseres Wissens hat diese Arbeit in Multiplexrichtung nicht zu Messungen an lebenden Zellen geführt.
Ein interessanter Ansatz, der von Dujardins Team vorgeschlagen wurde, stellt ein automatisiertes AFM vor, das in der Lage ist, Zellen zu identifizieren und sie am Boden von maßgeschneiderten Vertiefungen abbilden zu können. Obwohl diese Methode nicht die Analyse einer großen Population von Zellen ermöglicht, ermöglicht sie das automatische Testen verschiedener Bedingungen in jederVertiefung 11.
Unser Ziel in dieser Arbeit ist ehrgeiziger, da wir mindestens 1000 Zellen messen wollten, um nicht auf eine durchschnittliche Zelle zuzugreifen, sondern im Gegenteil auf die Heterogenität zwischen den Zellen. Die Strategie, die wir hier entwickelt haben, um mit AFM auf Zellpopulationsheterogenität zuzugreifen, basiert auf der Analyse von Hunderten von Zellen, auf denen eine begrenzte Anzahl von Kraftkurven aufgezeichnet wird. Im Vergleich zum “klassischen” Ansatz, eine große Anzahl von Kraftkurven auf einer begrenzten Anzahl von Zellen aufzuzeichnen, sollte dieser Ansatz als komplementär betrachtet werden, da er nicht die gleichen Informationen liefert. Während die typische Methode es ermöglicht, die Heterogenität einzelner Zelloberflächen zu untersuchen, sind wir mit unserem Ansatz in der Lage, auf die gesamte Heterogenität der Zellpopulation zuzugreifen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir eine Methode kombiniert, die Mikroben (hier die Hefeart Candida albicans)direkt in die Vertiefungen eines mikrostrukturierten PDMS-Stempels12immobilisiert und ein originelles Programm entwickelt, um die AFM-Spitze automatisch von Zelle zu Zelle13 zu bewegen und die mechanischen Eigenschaften jeder Zelle zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigste Verbesserung, die diese Methodik bietet, ist eine signifikante Erhöhung der Anzahl der gemessenen Zellen in einem bestimmten Zeitraum. Das Gegenstück ist eine Reduzierung der Anzahl der pro Zelle gemessenen Punkte. Dies bedeutet, dass diese Methode nicht für eine detaillierte Analyse einer einzelnen Zelle ausgelegt ist. Die Methode gilt nur für Zellen, die in die Vertiefungen des PDMS-Stempels passen. Der Stempel ist sehr vielseitig, während er Vertiefungen von 1,5 x 1,5 μm2 bis zu 6 x 6 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten FONCYCYT von CONACYT (Mexiko), dem französischen Außenministerium und der Université Paris 13 dank der finanziellen Unterstützung des internationalen Kooperationsprojekts ECOS-NORD mit dem Namen Nano-Palpation for diagnosis, No. 263337 (Mexiko) und MI5P02 (Frankreich) anerkennen. AMR bedankt sich für die finanzielle Unterstützung von SIP-IPN durch das Projekt Nr. 20195489. SPC wird durch ein PhD-Stipendium von CONACYT (Nr. 288029) und IPN durch die Cotutelle-Vereinbarung unterstützt, um ein doppeltes PhD-Zertifikat (IPN-UPS) zu erhalten. ED und CFD sind Forscher am Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Riferimenti
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
