אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס
Summary
פרוטוקול זה נועד להפוך מדידות AFM לאוטומטיות על מאות תאים מיקרוביאליים. ראשית, מיקרואורגניזמים משותקים למיקרו-מבנים של חותמות PDMS ולאחר מכן מאלצים מדידות ספקטרוסקופיה להתבצע באופן אוטומטי על מאות תאים משותקים.
Abstract
השיטה המוצגת במאמר זה נועדה להפוך את ניסויי Bio-AFM לאוטומטיים ואת הקלטת עקומות הכוח. באמצעות שיטה זו, ניתן להקליט עקומות כוחות על 1000 תאים ב 4 שעות באופן אוטומטי. כדי לשמור על זמן ניתוח של 4 שעות, מספר עקומות הכוח לכל תא מצטמצם ל- 9 או 16. השיטה משלבת תוכנית מבוססת Jython ואסטרטגיה להרכבת תאים על בסיס דפוסים מוגדרים. התוכנית, מיושם על Bio-AFM מסחרי, יכול למרכז את הקצה על התא הראשון של המערך ולאחר מכן להעביר, באופן אוטומטי, מתא לתא תוך הקלטת עקומות כוח על כל תא. באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן לגשת לפרמטרים הביופיזיים של התאים כגון קשיחותם, תכונות הדבק שלהם וכו ‘. עם האוטומציה ומספר גדול של תאים מנותחים, אפשר לגשת להתנהגות של אוכלוסיית התא. זוהי פריצת דרך בתחום הביו-AFM שבו הנתונים תועדו עד כה על כמה עשרות תאים בלבד.
Introduction
עבודה זו מספקת מתודולוגיה לביצוע מדידות כוח אוטומטיות על מאות תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הוא גם מספק שיטה לשיתוק מיקרואורגניזמים על חותמת מיקרו-מבנה PDMS התואמת לניסויי AFM שנערכו בסביבה נוזלית.
Bio-AFM היא טכנולוגיה מיוחדת מאוד הגה עבור יישומים בביולוגיה ולאחר מכן משמש לחקר תאים חיים. זה דורש מהנדס מיומן שיכול לנתח תא אחד באותו הזמן. בתנאים אלה, מספר התאים השונים שניתן לנתח הוא קטן למדי, אופייני 5 עד 10 תאים ב 4-5 שעות. עם זאת, כמות מדידות כוח נרשם על תא אחד הם בדרך כלל גבוה מאוד והוא יכול בקלות להגיע 1000. לפיכך, הפרדיגמה הנוכחית של מדידות כוח AFM על תאים חיים היא לתעד מאות עקומות כוח (FCs) אבל על מספר מוגבל של תאים.
סטטיסטית, גישה זו מוטלת בספק, ומעלה את סוגיית הייצוג של המדגם. אכן, קשה, למשל, להעריך את ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים על ידי מדידת תאים בודדים בלבד, גם אם נרשמות מאות מדידות על תאים מעטים אלה. עם זאת, על בסיס פרדיגמה זו נעשו התקדמות משמעותית בביופיזיקה, מיקרוביולוגיה וננו-רפואה1,2,3. ואכן, ניתוח ננומטר בקנה מידה של תאים בודדים סיפק מידע חדש על nanomechanics הסלולר, על הארגון של חלבונים transmembrane, או מנגנון הפעולה של תרופות מיקרוביאלית או נגד סרטן4,5,6,7. לאחרונה, עם זאת, מספר בדיקות ביומכניות תפוקה גבוהה שנערכו על תאים הופיעו8, מראה את העניין של הקהילה המדעית בשינוי פרדיגמה זו וגישה הטרוגניות אוכלוסיית התא. בדיקות אלה מסתמכות כולן על מערכות מיקרופלואידיות כדי לעוות תאים ולמדוד אופטית את העיוות שלהם תחת לחץ כדי להשיג מדד עקיף של גמישות פני השטח הכוללת שלהם8. עם זאת, בעיה חשובה בשיטות אלה היא שהן מונו-פרמטריות: ניתן לחקור רק גמישות תאים. יתר על כן, הם אינם מאפשרים מדידה של הפרמטרים המכניים של תאים חסידים, אשר יכול להיות מגביל למחקרים של תאי יונקים noncirculating או biofilms למשל.
גישות המערבות AFM פותחו על ידי הצוותים של S. Scheuring9 ו M. Favre10. Scheuring et al. תאים משותקים על דפוסי fibronectin9, מכריח תאים בודדים לקחת את הצורה של התבנית9. לאחר מכן צוות זה מיפה את המאפיינים המכניים של כמה תאים כדי להגדיר נתונים ממוצעים, המייצגים 14 עד 18 תאים. הפיתוח שבוצע על ידי Farve et al. שמטרתו מולטיפלקס המדידות על ידי מקבילות AFM cantilevers10. למיטב ידיעתנו, עבודה זו בכיוון מולטיפלקסים לא הובילה למדידות על תאים חיים.
גישה מעניינת המוצעת על ידי הצוות של Dujardin מציג AFM אוטומטי מסוגל לזהות תאים הדמיה אותם בתחתית בארות בהתאמה אישית. למרות שיטה זו אינה מאפשרת ניתוח של אוכלוסייה גדולה של תאים, זה מאפשר בדיקה אוטומטית של תנאים שונים בכל באר11.
המטרה שלנו בעבודה זו היא שאפתנית יותר שכן רצינו למדוד לפחות 1000 תאים כדי לגשת לא תא ממוצע, אבל, להיפך, את ההטרוגניות בין התאים. האסטרטגיה שפיתחנו כאן כדי לגשת להטרוגניות של אוכלוסיית התאים באמצעות AFM מבוססת על ניתוח של מאות תאים שעליהם נרשם מספר מוגבל של עקומות כוח. בהשוואה לגישה “הקלאסית” של רישום מספר רב של עקומות כוח על מספר מצומצם של תאים, גישה זו צריכה להיחשב כמשלים שכן היא אינה מספקת את אותו מידע. ואכן, בעוד השיטה האופיינית מאפשרת לאדם לחקור הטרוגניות משטח תא בודד, באמצעות הגישה שלנו, אנו מסוגלים לגשת הטרוגניות אוכלוסיית התא כולו. כדי להשיג מטרה זו, שילבנו שיטה שמשתקת ישירות מיקרואורגניזמים (כאן מיני השמרים קנדידה אלביקנס) לבארות של חותמת מיקרו-בנייה של PDMS12, ומפתחת תוכנית מקורית להעברת קצה AFM, באופן אוטומטי, מתא לתא13 ומדידת התכונות המכאניות של כל תא.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיפור העיקרי שמספקת מתודולוגיה זו הוא עלייה משמעותית במספר התאים הנמדדים בזמן שנקבע. המקבילה היא הפחתה של מספר הנקודות הנמדדות לכל תא. משמעות הדבר היא כי שיטה זו אינה מיועדת לספק ניתוח מפורט של תא יחיד. השיטה חלה רק על תאים שיכולים להתאים לבארות של חותמת PDMS. החותמת היא רב-תכליתית למדי, בעו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להכיר FONCYCYT של CONACYT (מקסיקו), משרד החוץ של צרפת ואת האוניברסיטה פריז 13, אם כי התמיכה הכספית של פרויקט ECOS-NORD שיתוף פעולה בינלאומי בשם ננו-מישוש לאבחון, מס ‘263337 (מקסיקו) ו MI5P02 (צרפת). AMR רוצה להודות על התמיכה הכספית של SIP-IPN באמצעות הפרויקט מס ‘20195489. SPC נתמכת על ידי מלגת דוקטורט מ- CONACYT (מס ‘ 288029) ו- IPN באמצעות הסכם cotutelle לקבלת תעודת דוקטורט כפולה (IPN-UPS). אד ו CFD הם חוקרים במרכז הלאומי דה לה Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Riferimenti
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
