쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작
Summary
이 문서에서는 쥐 하악에서 골수 메선 줄기 세포를 분리, 재배, 선별 및 식별하기 위한 전체 골수 준수 및 유동 세포 측정 선별을 결합하는 방법을 제시합니다.
Abstract
여기서 우리는 실험 요구 사항에 대한 수많은 고품질 세포를 빠르게 얻기 위해 시험관에서 하골 골수 중년 줄기 세포 (mBMSC)를 격리하고 배양하는 효율적인 방법을 제시합니다. mBMSC는 우수한 자기 갱신 능력과 다중 계보 분화 잠재력으로 인해 미래에 두개골 면질환 및 두개골 -상악안면 재생의 경우 조직 공학 세포로서 치료 응용 분야에서 널리 사용될 수 있습니다. 따라서 대량으로 mBMSC를 얻는 것이 중요합니다.
이 연구에서는, 골수는 하악에서 플러시되었고 1 차적인 mBMSCs는 전체 골수 부착 재배를 통해 격리되었다. 또한, CD29+CD90+CD45– mBMSC는 형광 세포 분류를 통해 정제되었다. 정제 된 mBMSC의 2 세대는 추가 연구를 위해 사용되었고 골세포, 지방 세포 및 연골 세포로 분화할 수있는 잠재력을 표시했습니다. 이를 활용한 시험관 내 모델을 활용하여 생물학적 특성, 마이크로 환경에 대한 후속 반응 및 mBMSC의 다른 응용 분야의 연구를 용이하게 할 수 있는 많은 수의 증식 mBMSC를 얻을 수 있다.
Introduction
골수 관두 줄기 세포(BMSC)는 골수로부터 유래된 비-조혈 줄기 세포로, 강력한 증식 능력과 다중 계측 분화 전위1,2,3,4를나타낸다. 실제로, BMSCs는 뼈 조직 공학 및 재생을 위한 이상적인 후보로 그(것)들이 발견된 이래로 여겨졌습니다. 수년 동안, 경골과 대퇴골과 같은 장골 문장 또는 긴 뼈는 두개안 면재생을 위한 BMSCs의 일반적인 근원이었습니다. 그러나, 하악 BMSC(mBMSC)와 같은 오로페이셜 BMSC는 상이한 배아 기원 및 발달 패턴과 같은 긴 뼈 BMSC로부터 약간의 차이를 표시합니다. 하악은 신경 절제술 세균 층의 신경 문장 세포에서 발생하고 관상 골화를 겪는 반면, 축 및 부속 골격은 중년에서 온 것이며 내뇌부 진동을 겪습니다. 더욱이, 임상 관찰 및 실험동물 연구는 지속적으로 오로페이셜과 일악 문장 BMSC5,6,7,8사이에 기능적 차이가 있음을 나타내고있다. 보고서에 따르면 BMSC는 하악, 상악뼈 및 폐포 뼈와 같은 두개골 면성 뼈에서 유래한 것으로 나타났으며, 축 및 부속뼈9보다우수한 증식, 수명 및 분화 능력을 나타냈다. 따라서 mBMSC는 케루비즘, 턱 종양, 턱 뼈의 골다공증 및 치주 조직 결함10,11,12와같은 두개골 면질환의 미래 치료적용을위한 바람직한 자원으로 간주됩니다. 전임상 실험에서 치료 잠재력을 이해하려면 시험관내에서 mBMSC를 빠르게 격리하고 배양하는 방법을 확립하는 것이 필수적입니다.
이 연구에서는, 목표는 전체 골수 준수 및 흐름 세포 측정 분류에 의해 정제 된 mBMSC를 얻는 것이었습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (Micro-CT) 및 조직학적 섹션을 통해 명확하게 관찰 된 쥐 하악의 해부학 적 형태는 하악의 궤적 뼈가 절개 수막 공간과 폐포 뼈 사이에 있음을 보여 주었다. 궤적 골수로부터의 골수는 하악골 세포를 얻기 위해 플러시되었지만, 이런 식으로 배양된 세포는 순수한 mBMSC가 아니었으며 뼈, 지방 및 내피 세포로부터의 세포와 같은 다양한 혈통을 가진 여러 유형의 세포로 구성될 가능성이 있었다13,14. 세포 정화의 다음 단계는 특히 중요했다. 유동 세포질은 세포 표면 단백질의 조합을 인식함으로써 세포를 필터링하고 중간엽 줄기 세포의 농축에 널리 채택되어 왔다. 세포 균질성은 유동 세포측정의 주요 장점이지만, 공정은 세포 생존가능성을 결정하지 못하고 제한된 세포 수율을 초래할 수 있다. 이 연구에서는, 전체 골수 준수에서 얻은 P0 mBMSC는 높은 순도와 강한 증식 능력을 가진 mBMSC를 얻기 위하여 유동 세포질에 의해 분류되었습니다.
이 연구는 전체 골수 준수 및 유동 세포 측정 선별의 조합을 사용하여 쥐 하악 BMSC의 격리, 문화 및 분화를 위한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 소개합니다. 관련 분야의 연구원이 사용할 수 있는 안정적이고 편리한 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 전체 골수 준수 및 형광 세포 분류를 결합하여 체외에서 쥐 하악에서 BMSC를 분리하는 방법을 설명하며, 이는 강력한 분화 능력으로 증식 mBMSC를 얻을 수있는 간단하고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 방법은 유동 셀 정렬에 의해 mBMSC를 예열적으로 정화할 수 있지만 세포 균질성에 대한 요구 사항이 더 높은 경우 보다 정확한 정제 방법이 필요할 수 있습니다.
현재…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
상하이 9대 인민병원의 두개안면 이상에 대한 디지털화된 스토마토로지 연구센터의 도움을 주셔서 감사합니다. 이 원고의 작품은 중국 국립 자연과학재단(NSFC)[81570950,81870740,81800949]의 보조금으로 지원되고, 상하이 서밋 & 고원 분야, 상하이 정밀 의학 연구소, 상하이 9인조 병원, 상하이 자오동 의과대학 [JC201809], 상하이 자오동 대학 의과대학 고원혁신팀 인센티브 프로젝트. L.J.는 우수 청소년 의료 인재, 상하이 “의학 재능의 떠오르는 별” 청소년 개발 프로그램 및 상하이 자오퉁 대학의 “첸 싱” 프로젝트의 학자입니다.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
