Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas
Summary
Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.
Abstract
Aquí presentamos un método eficiente para aislar y cultivar células madre mesenquimales de médula ósea mandibular (mBMSCs) in vitro para obtener rápidamente numerosas células de alta calidad para los requisitos experimentales. Los mBMSCs podrían ser ampliamente utilizados en aplicaciones terapéuticas como células de ingeniería de tejidos en caso de enfermedades craneofaciales y regeneración craneo-maxilofacial en el futuro debido a la excelente capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación multi-linaje. Por lo tanto, es importante obtener mBMSCs en grandes cantidades.
En este estudio, la médula fue limpiada con un chorro de agua de la mandíbula y los mBMSCs primarios fueron aislados con la cultivación adherente entera de la médula. Además, CD29+CD90+CD45− mBMSCs fueron purificados a través de la clasificación de células fluorescentes. La segunda generación de mBMSCs purificados fue utilizada para el estudio adicional y exhibió potencial en el distinción en osteoblasts, adipocytes, y chondrocytes. Utilizando este modelo in vitro, se puede obtener un alto número de mBMSCs proliferativos, lo que puede facilitar el estudio de las características biológicas, la reacción posterior al microambiente y otras aplicaciones de los mBMSCs.
Introduction
Las células madre mesenquimales de médula ósea (BMSCs) son células madre no hematopoyéticas derivadas de la médula ósea que manifiestan una fuerte capacidad de proliferación y un potencial de diferenciación de múltipleslinajes 1,2,3,4. De hecho, los BMSCs han sido considerados como un candidato ideal para la ingeniería y regeneración de tejidos óseos desde que fueron descubiertos. Durante años, la cresta ilíaca o los huesos largos como la tibia y el fémur han sido la fuente más común de BMSCs para la regeneración craneofacial. Sin embargo, los BMSCs orofaciales, como los BMSCs de la mandíbula (mBMSCs), muestran algunas diferencias de los BMSCs de hueso largo, como el origen embrionario diferente y el patrón de desarrollo. Las mandíbulas surgen de las células neurales de la cresta de la capa germinal del neuroectodermo y se someten a la osificación intramembranosa, mientras que los esqueletos axiales y apendiculares son del mesodermo y se someten a la osificación endocondral. Además, las observaciones clínicas y los estudios experimentales en animales han indicado consistentemente que existen diferencias funcionales entre la cresta orofacial e ilíaca BMSCs5,6,7,8. Los informes han demostrado que los BMSCs derivados del hueso craneofacial, como la mandíbula, el hueso maxilar y el hueso alveolar, exhibieron una proliferación, una vida y una capacidad de diferenciación superiores a las de los huesos axiales y apendiculares9. Los mBMSCs, por lo tanto, se consideran los recursos preferidos para futuras aplicaciones terapéuticas de enfermedades craneofaciales como el querubismo, el tumor de mandíbula, la osteoporosis del hueso de la mandíbula y el defecto del tejido periodontal10,11,12. Para entender el potencial del tratamiento en experimentos preclínicos, es esencial establecer un método para aislar y cultivar rápidamente mBMSCs in vitro.
En este estudio, el objetivo fue obtener mBMSCs purificados por adherencia de médula ósea entera y clasificación por citometría de flujo. La morfología anatómica de la mandíbula de la rata, observada claramente con la tomografía computada micro (Micro-CT) y las secciones histológicas, demostró que el hueso trabecular de la mandíbula estaba entre el espacio medular de la incisivo y el hueso alveolar. La médula ósea del hueso trabecular se enjuagaba para obtener células de médula mandibular, pero las células cultivadas de esta manera no eran mBMSCs puros y eran susceptibles de consistir en múltiples tipos de células con potencias inciertas y diversos linajes como células de células óseas, grasas y endoteliales13,14. El siguiente paso de la purificación celular fue particularmente importante. La citometría de flujo filtra las células mediante el reconocimiento de una combinación de proteínas de la superficie celular y ha sido ampliamente adoptada en el enriquecimiento de las células madre mesenquimales. La homogeneidad celular es la principal ventaja de la citometría de flujo, pero el proceso no determina la viabilidad celular y puede resultar en un rendimiento celular limitado. En este estudio, los mBMSCs P0 obtenidos de la adherencia entera de la médula fueron clasificados por cytometry de flujo para obtener los mBMSCs con alta pureza y capacidad fuerte de la proliferación.
Este estudio introduce un protocolo reproducible y confiable para el aislamiento, la cultura, y la diferenciación de la mandíbula BMSCs de la rata usando una combinación de adherencia entera de la médula y de la clasificación cytometry de flujo. Es un método confiable y conveniente para que los investigadores en campos relacionados lo usen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para aislar BMSCs de mandíbulas de la rata in vitro combinando adherencia entera de la médula y la clasificación fluorescente de la célula, que es una manera simple y confiable de obtener mBMSCs proliferativos con capacidad fuerte de la diferenciación. Este método podría purificar preliminarmente mBMSCs por la clasificación de células de flujo, pero si hay requisitos más altos para la homogeneidad celular, se pueden requerir métodos de purificación más precisos.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos la asistencia del Laboratorio de Estomatología Digitalizada y el Centro de Investigación de Anomalías Craneofaciales del Noveno Hospital Popular de Shanghai. El trabajo de este manuscrito está respaldado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, el fondo SHIPM-mu del Instituto de Medicina de Precisión de Shanghai, el Noveno Hospital Popular de Shanghai, la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai [JC201809], el Proyecto de Incentivo del Equipo de Innovación de Alto Nivel para la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai. Y L.J. es un académico de los Talentos Médicos Juveniles Sobresalientes, el Programa de Desarrollo Juvenil “Rising Stars of Medical Talent” de Shanghai y el proyecto “Chen Xing” de la Universidad Jiaotong de Shanghai.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
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