Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi
Summary
Bu makalede, sıçan mandibulalarından kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek, yetiştirmek, sıralamak ve tanımlamak için tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralamasını birleştiren bir yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Burada, deneysel gereksinimler için çok sayıda yüksek kaliteli hücreyi hızla elde etmek için mandibuler kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (mBMSC’ ler) in vitro izole etmek ve kültleştirmek için etkili bir yöntem sunuyoruz. mBMSC’ler, mükemmel kendini yenileme yeteneği ve çok soylu farklılaşma potansiyeli nedeniyle gelecekte kraniyofasiyal hastalıklar ve kraniyo-maksillofasiyal rejenerasyon durumunda doku mühendisliği hücreleri olarak terapötik uygulamalarda yaygın olarak kullanılabilir. Bu nedenle, mBMSC’leri çok sayıda elde etmek önemlidir.
Bu çalışmada kemik iliği mandibuladan yıkanmış ve primer mBMSC’ler tüm kemik iliği yapışmış ekimi ile izole edilmiştir. Ayrıca, CD29+CD90+CD45− mBMSC’ler floresan hücre sıralama yoluyla saflaştırılmıştır. İkinci nesil saflaştırılmış mBC’ler daha fazla çalışma için kullanıldı ve osteoblastlara, adipositlere ve kondrositlere farklılaşma potansiyeli gösterdi. Bu in vitro modeli kullanarak, biyolojik özelliklerin incelenmesini, mikroçevrime sonraki reaksiyonları ve mBMSC’lerin diğer uygulamalarını kolaylaştırabilecek yüksek sayıda proliferatif mBMSC elde edilebilir.
Introduction
Kemik iliği mezenkimal kök hücreler (BMSC’ ler), kemik iliğinden elde edilen ve güçlü çoğalma yeteneği ve çok soylu farklılaşma potansiyeli gösteren hematopoetik olmayan kök hücrelerdir1,2,3,4. Nitekim BMSC’ler keşfedildiklerinden beri kemik doku mühendisliği ve yenilenmesi için ideal bir aday olarak kabul edilmiştir. Yıllardır, iliak tepe veya kaval kemiği ve uyluk kemiği gibi uzun kemikler kraniyofasiyal rejenerasyon için BMSC’lerin en yaygın kaynağı olmuştur. Bununla birlikte, mandibuler BMSC’ler (mBMSC’ler) gibi orofasiyal BMSC’ler, farklı embriyonik köken ve gelişim patörü gibi uzun kemik BMSC’lerinden bazı farklılıklar gösterir. Mandibulalar nöroektoderm mikrop tabakasının nöral kret hücrelerinden kaynaklanır ve intramembranöz kemikleşmeye uğrar, eksenel ve apandisitrik iskeletler ise mezodermdendir ve endochondral kemikleşmeye uğrar. Ayrıca, klinik gözlemler ve deneysel hayvan çalışmaları sürekli olarak orofacial ve iliak kret BMSC’ler 5,6,7,8arasında fonksiyonel farklılıklar olduğunubelirtmiştir. Raporlar, mandibula, maksiller kemik ve alveolar kemik gibi kraniyofasiyal kemikten elde edilen BMSC’lerin eksenel ve apandisiler kemiklerden üstün çoğalma, yaşam süresi ve farklılaşma yeteneği sergilediğini göstermiştir9. Bu nedenle mBMSC’ler, cherubism, çene tümörü, çene kemiği osteoporoz ve periodontal doku defekti10 , 11,12gibi kraniyofasiyal hastalıkların gelecekteki terapötik uygulamaları için tercih edilen kaynaklar olarak kabul edilir. Preklinik deneylerde tedavi potansiyelini anlamak için, mBMSC’lerin in vitro olarak hızla izole edilmesi ve kült haline getirmek için bir yöntem oluşturmak esastır.
Bu çalışmada tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi tasnifi ile saflaştırılmış mBMSC’lerin elde etmesi amaçlanmıştı. Mikro bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) ve histolojik bölümler ile açıkça gözlenen fare mandibulasının anatomik morfolojisi, mandibulanın trabeküler kemiğinin kesici medüller boşluk ile alveolar kemik arasında olduğunu göstermiştir. Trabeküler kemik kemiğinden kemik iliği mandibular ilik hücreleri elde etmek için yıkandı, ancak bu şekilde kültürlenen hücreler saf mBC’ler değildi ve kemik, yağ ve endotel hücrelerinden hücreler gibi belirsiz potenslere ve çeşitli soylara sahip birden fazla hücre türünden oluşması muhtemeldi13,14. Hücre saflaştırmanın bir sonraki adımı özellikle önemliydi. Akış sitometrisi, hücre yüzeyi proteinlerinin bir kombinasyonunu tanıyarak hücreleri filtreler ve mezenkimal kök hücrelerin zenginleştirilmesinde yaygın olarak benimsenmiştir. Hücre homojenliği akış sitometrisinin ana avantajıdır, ancak işlem hücre canlılığını belirlemez ve sınırlı hücre verimi ile sonuçlanabilir. Bu çalışmada, tüm kemik iliği yapışmasından elde edilen P0 mBMSC’ler, yüksek saflık ve güçlü çoğalma kapasitesine sahip mBMSC’ler elde etmek için akış sitometrisine göre sıralanmıştır.
Bu çalışma, tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralama kombinasyonu kullanılarak sıçan mandibular BMSC’lerin izolasyonu, kültürü ve farklılaşması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir protokol sürmektedir. İlgili alanlardaki araştırmacıların kullanması için güvenilir ve kullanışlı bir yöntemdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, güçlü farklılaşma yeteneğine sahip proliferatif mBMSC’ler elde etmenin basit ve güvenilir bir yolu olan tüm kemik iliği yapışması ve floresan hücre sıralamasını birleştirerek BMSC’leri fare mandibulalarından in vitro olarak izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, akış hücresi sıralama ile mBMSC’leri önceden saflaştırabilir, ancak hücre homojenliği için daha yüksek gereksinimler varsa, daha kesin saflaştırma yöntemleri gerekebilir.
<p class="jove_conte…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Kraniyofasiyal Anomaliler Için Dijitalleştirilmiş Stomatoloji ve Araştırma Merkezi Laboratuvarı’nın yardımı için teşekkür ederiz. Bu makalenin çalışmaları Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın (NSFC) hibeleriyle desteklenmektedir [81570950,81870740,81800949], Şanghay Zirvesi & Plato Disiplinleri, Şanghay Hassas Tıp Enstitüsü’nden SHIPM-mu fonu, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi [JC201809], Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi için Üst Düzey İnovasyon Ekibinin Teşvik Projesi. Ve L.J. Üstün Gençlik Tıbbi Yetenekleri, Şanghay “Tıbbi Yeteneğin Yükselen Yıldızları” Gençlik Geliştirme Programı ve Şanghay Jiaotong Üniversitesi’nden “Chen Xing” projesinin bir bilginidir.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
