عزل وزراعة الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية النخاعية في الفئران
Summary
تقدم هذه المقالة طريقة تجمع بين الالتزام بنخاع العظم بالكامل وفرز قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية من الفك السفلي للفئران وزراعةها وفرزها وتحديدها.
Abstract
هنا نقدم طريقة فعالة لعزل وزراعة نخاع العظم الفك السفلي الخلايا الجذعية المتوسطة (mBMSCs) في المختبر للحصول بسرعة على العديد من الخلايا عالية الجودة لمتطلبات تجريبية. يمكن استخدام mBMSCs على نطاق واسع في التطبيقات العلاجية كخلايا هندسية للأنسجة في حالة الأمراض القحفية الوجهية وتجديد الوجه والفكين في المستقبل بسبب القدرة الممتازة على التجديد الذاتي وإمكانات التمايز متعددة النسب. لذلك، من المهم الحصول على mBMSCs بأعداد كبيرة.
في هذه الدراسة، تم مسح نخاع العظام من الفك السفلي وتم عزل mBMSCs الأولية من خلال زراعة نخاع العظم كله. وعلاوة على ذلك، تم تنقية CD29+CD90+CD45– mBMSCs من خلال فرز الخلايا الفلورية. تم استخدام الجيل الثاني من mBMSCs المنقى لمزيد من الدراسة وعرض إمكانات في التفريق إلى الأروميات العظمية، والخلايا الدهنية، وخلايا الشوندروسيتي. وباستخدام هذا النموذج في المختبر، يمكن للمرء أن يحصل على عدد كبير من مركبات MBMSCs التكاثرية، مما قد يسهل دراسة الخصائص البيولوجية، والتفاعل اللاحق مع البيئة الدقيقة، وغيرها من تطبيقات مركبات الكربون الهيدروفلورية.
Introduction
نخاع العظم الخلايا الجذعية المتوسطة (BMSCs) هي الخلايا الجذعية غير الموبوائية المستمدة من نخاع العظام التي تظهر قدرة انتشار قوية وتمايز متعدد النسبالمحتملة 1،2،3،4. في الواقع ، تم اعتبار BMSCs كمرشح مثالي لهندسة الأنسجة العظمية وتجديدها منذ اكتشافها. لسنوات، كانت قمة الحرقفي أو العظام الطويلة مثل الساق وعظم الفخذ المصدر الأكثر شيوعا لBMSCs لتجديد القحف الوجهي. ومع ذلك، فإن مركبات BMSCs الأورو-الوجهية، مثل BMSCs الفك السفلي (mBMSCs)، تظهر بعض الاختلافات عن BMSCs العظام الطويلة، مثل الأصل الجنيني المختلف ونمط النمو. تنشأ الفك السفلي من خلايا القمة العصبية للطبقة الجرثومية العصبية وتخضع للتحجر داخل الممبر ، في حين أن الهياكل العظمية المحورية والملحقية هي من mesoderm وتخضع للتحجر الداخلي. وعلاوة على ذلك، أشارت الملاحظات السريرية والدراسات الحيوانية التجريبية باستمرار إلى أن هناك اختلافات وظيفية بين أوروفاسيال و إيلياك كريست BMSCs5،6،7،8. وقد أظهرت التقارير أن BMSCs المستمدة من العظام القحفية الوجهية مثل الفك السفلي، والعظام الفك العلوي، والعظام الحوفية أظهرت انتشار متفوقة، والعمر الافتراضي، والقدرة على التمايز من تلك من العظام المحورية والملحقية9. mBMSCs، لذلك، تعتبر الموارد المفضلة للتطبيقات العلاجية المستقبلية للأمراض القحفية الوجهية مثل الكشمة، ورم الفك، هشاشة العظام الفك، وعيب الأنسجة اللثة10،11،12. لفهم إمكانات العلاج في التجارب ما قبل السريرية، من الضروري إنشاء طريقة لعزل وزراعة mBMSCs بسرعة في المختبر.
في هذه الدراسة، كان الهدف هو الحصول على mBMSCs المنقى عن طريق الالتزام نخاع العظام كله وتدفق فرز الخلايا. أظهر المورفولوجيا التشريحية للفك السفلي للفئران ، التي لوحظت بوضوح من خلال التصوير المقطعي الدقيق (Micro-CT) والأقسام النسيجية ، أن العظم التربيكي للفك السفلي كان بين الفضاء النخاعي القاطع وعظم الحويصلات الهوائية. تم مسح نخاع العظم من العظام الطرية للحصول على خلايا النخاع الفك السفلي ، ولكن الخلايا المستزرعة بهذه الطريقة لم تكن mBMSCs نقية وكان من المرجح أن تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ذات الفعالية غير المؤكدة والأناساب المتنوعة مثل الخلايا من خلايا العظام والدهون والخلايا البطانية13،14. وكانت الخطوة التالية لتنقية الخلايا ذات أهمية خاصة. تدفق قياس الخلايا مرشحات الخلايا من خلال التعرف على مزيج من البروتينات سطح الخلية، وقد اعتمدت على نطاق واسع في إثراء الخلايا الجذعية mesenchymal. تجانس الخلية هو الميزة الرئيسية لقياس التدفق الخلوي، ولكن العملية لا تحدد صلاحية الخلية ويمكن أن تؤدي إلى إنتاجية محدودة للخلايا. في هذه الدراسة، تم فرز P0 mBMSCs التي تم الحصول عليها من الالتزام نخاع العظام كله حسب قياس التدفق الخلوي للحصول على mBMSCs مع نقاء عالية وقدرة انتشار قوية.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا قابلا للاستنساخ وموثوقا به للعزلة والثقافة والتمايز بين مركبات BMSC الفك السفلي للفئران باستخدام مزيج من الالتزام بنخاع العظم الكامل وفرز قياس التدفق الخلوي. وهي طريقة موثوقة ومريحة للباحثين في المجالات ذات الصلة لاستخدامها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل BMSCs من الفك السفلي للفئران في المختبر من خلال الجمع بين الالتزام بنخاع العظم الكامل وفرز الخلايا الفلورية ، وهي طريقة بسيطة وموثوقة للحصول على mBMSCs التكاثرية بقدرة تمييز قوية. يمكن لهذه الطريقة تنقية mBMSCs بشكل أولي عن طريق فرز خلايا التدفق ، ولكن إذا كانت هناك م…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر على مساعدة مختبر أمراض الفم الرقمية ومركز البحوث للتشوهات القحفية الوجهية في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي. يدعم عمل هذه المخطوطة منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (NSFC) [81570950,81870740,81800949], شنغهاي قمة وهضبة التخصصات، صندوق SHIPM-mu من معهد شنغهاي للطب الدقيق، شنغهاي مستشفى الشعب التاسع، شنغهاي جياو تونغ كلية الطب جامعة [JC201809]، المشروع الحافز لفريق الابتكار رفيع المستوى لكلية الطب في جامعة جياو تونغ شنغهاي. و ل. ج. هو باحث في برنامج تنمية الشباب المتميز للمواهب الطبية للشباب، وبرنامج شنغهاي “النجوم الصاعدة للمواهب الطبية” لتنمية الشباب، ومشروع “تشن شينغ” من جامعة جياوتونغ في شنغهاي.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
