Isolement et culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire chez le rat
Summary
Cet article présente une méthode qui combine l’adhérence entière de moelle et le tri cytometry d’écoulement pour isoler, cultiver, trier, et identifier des cellules souches mésenchymateuses de moelle des mâchoires de rat.
Abstract
Nous présentons ici une méthode efficace pour isoler et cultiver des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire (mBMSCs) in vitro afin d’obtenir rapidement de nombreuses cellules de haute qualité pour des exigences expérimentales. MBMSCs pourrait être largement utilisé dans des applications thérapeutiques comme cellules d’ingénierie tissulaire en cas de maladies craniofaciales et de régénération cranio-maxillofaciale à l’avenir en raison de l’excellente capacité d’auto-renouvellement et du potentiel de différenciation multi-lignée. Par conséquent, il est important d’obtenir des mBMSCs en grand nombre.
Dans cette étude, la moelle a été rincée de la mâchoire inférieure et mBMSCs primaires ont été isolés par la culture adhérente entière de moelle. De plus, les CD29+CD90+CD45− mBMSCs ont été purifiés par tri des cellules fluorescentes. La deuxième génération de mBMSCs purifiés a été employée pour davantage d’étude et a montré le potentiel en différenciant en osteoblasts, adipocytes, et chondrocytes. En utilisant ce modèle in vitro, on peut obtenir un nombre élevé de mBMSCs prolifératifs, ce qui peut faciliter l’étude des caractéristiques biologiques, la réaction subséquente au microenvironnement, et d’autres applications des mBMSCs.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) sont des cellules souches non hématopoïétiques dérivées de la moelle osseuse qui manifestent une forte capacité de prolifération et un potentiel de différenciation multi-lignée1,2,3,4. En effet, les BMSC ont été considérés comme un candidat idéal pour l’ingénierie et la régénération des tissus osseux depuis leur découverte. Pendant des années, la crête iliaque ou les longs os tels que le tibia et le fémur ont été la source la plus commune de BMSCs pour la régénération craniofacial. Cependant, les BMSC orofaciales, telles que les BMSCs mandibulaires (mBMSCs), montrent quelques différences par rapport aux BMSCs d’os long, telles que l’origine embryonnaire différente et le modèle de développement. Les mâchoires-nez résultent des cellules neurales de crête de la couche de germe de neuroectoderm et subissent l’ossification intramembranous, alors que les squelettes axiaux et appendiculaires sont du mesoderm et subissent l’ossification endochondral. De plus, les observations cliniques et les études expérimentales sur les animaux ont constamment indiqué qu’il existe des différences fonctionnelles entre les BMSC orofaciales et iliaques5,6,7,8. Les rapports ont prouvé que BMSCs dérivé de l’os craniofacial tel que la mâchoire inférieure, l’os maxillaire, et l’os alvéolaire ont montré la prolifération supérieure, la durée, et la capacité de différentiation que ceux des os axiaux et appendiculaires9. Les mBMSCs sont donc considérés comme les ressources privilégiées pour les futures applications thérapeutiques des maladies craniofaciales telles que le chérubinisme, la tumeur de la mâchoire, l’ostéoporose de l’os de la mâchoire et le défaut du tissu parodontal10,11,12. Pour comprendre le potentiel de traitement dans les expériences précliniques, il est essentiel d’établir une méthode pour isoler et cultiver rapidement les mBMSCs in vitro.
Dans cette étude, le but était d’obtenir des mBMSCs purifiés par l’adhérence entière de moelle et le tri cytométrique de flux. La morphologie anatomique de la mâchoire inférieure de rat, clairement observée par la micro tomographie calculée (Micro-CT) et les sections histologiques, a prouvé que l’os trabecular de la mâchoire inférieure était entre l’espace médullaire d’incisives et l’os alvéolaire. La moelle osseuse de l’os trabéculaire a été rincée pour obtenir des cellules mandibulaires de la moelle osseuse, mais les cellules ainsi cultivées n’étaient pas des mBMSCs purs et étaient susceptibles d’être constituées de multiples types de cellules aux puissances incertaines et aux lignées diverses telles que les cellules des cellules osseuses, adipeuses et endothéliales13,14. La prochaine étape de la purification cellulaire était particulièrement importante. La cytométrie en flux filtre les cellules en reconnaissant une combinaison de protéines cellule-surface et a été largement adoptée dans l’enrichissement des cellules souches mésenchymateuses. L’homogénéité cellulaire est le principal avantage de la cytométrie en flux, mais le processus ne détermine pas la viabilité cellulaire et peut entraîner un rendement cellulaire limité. Dans cette étude, les mBMSCs P0 obtenus à partir de l’adhérence entière de moelle ont été triés par cytométrie de flux pour obtenir des mBMSCs avec la haute pureté et la capacité forte de prolifération.
Cette étude introduit un protocole reproductible et fiable pour l’isolement, la culture, et la différenciation de BMSCs mandibulaire de rat utilisant une combinaison d’adhérence entière de moelle et de tri cytometry d’écoulement. C’est une méthode fiable et pratique à utiliser pour les chercheurs dans des domaines connexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour isoler bmscs des mâchoires de rat in vitro en combinant l’adhérence entière de moelle et le tri de cellules fluorescentes, qui est un moyen simple et fiable d’obtenir mBMSCs prolifératifs avec la capacité forte de différenciation. Cette méthode pourrait purifier à titre préliminaire les mBMSC par tri des cellules d’écoulement, mais s’il y a des exigences plus élevées en matière d’homogénéité cellulaire, des méthodes de purification plus précises peuvent ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Laboratoire de stomatologie numérisée et le Centre de recherche sur les anomalies craniofaciales du neuvième hôpital populaire de Shanghai. Le travail de ce manuscrit est soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, le fonds SHIPM-mu de Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], le projet d’incitation de l’équipe d’innovation de haut niveau pour Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Et L.J. est un chercheur du programme de développement des jeunes talents médicaux exceptionnels, du programme de développement des jeunes « Rising Stars of Medical Talent » de Shanghai et du projet « Chen Xing » de l’Université Jiaotong de Shanghai.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
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