Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy
Summary
De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.
Abstract
De rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten is een cruciaal probleem voor hun toepassing in regeneratieve therapie, drugstesten en ziektemodellering. Ondanks de ontwikkeling van meerdere differentiatieprotocollen blijft de generatie iPSC cardiomyocyten die lijken op een volwassen fenotype een uitdaging. Een belangrijk aspect van cardiomyocyten rijping omvat de vorming van een goed georganiseerd sarcomere netwerk om een hoge contractiecapaciteit te garanderen. Hier presenteren we een super resolutie-gebaseerde aanpak voor semi-kwantitatieve analyse van het α-actinin netwerk in cardiomyocyten. Met behulp van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie werd een vergelijking gemaakt van de sarcomerelengte en de z-discdikte van iPSC-afgeleide cardiomyocyten en hartcellen geïsoleerd van neonatale weefsel. Tegelijkertijd tonen we het belang aan van goede beeldvormingsvoorwaarden om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Onze resultaten tonen aan dat deze methode geschikt is om de structurele rijpheid van hartcellen met een hoge ruimtelijke resolutie kwantitatief te monitoren, waardoor zelfs subtiele veranderingen van de sarcomere organisatie kunnen worden gedetecteerd.
Introduction
Hart- en vaatziekten (CVD) zoals een hartinfarct of cardiomyopathie blijven de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse wereld1. Aangezien het menselijk hart slechts een slechte regeneratieve capaciteit bezit, is er behoefte aan strategieën om het herstel van CVD’s te bevorderen. Dit omvat celvervangende therapieën om verloren cardiomyocyten (CM) aan te vullen, evenals de ontwikkeling van nieuwe antiritmische geneesmiddelen voor efficiënte en veilige farmaceutische interventie. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn aangetoond dat een veelbelovende celbron voor de onbeperkte generatie van menselijke CM in vitro, geschikt voor regeneratieve therapieën, ziekte modellering, en voor de ontwikkeling van screening testen van geneesmiddelen2,3,4.
Hoewel er veel verschillende cardiale differentiatieprotocollen bestaan, ontbreekt het iPSC-afgeleide CM nog steeds aan bepaalde fenotypische en functionele aspecten die de in vitro en in vivo toepassing5,6belemmeren . Naast elektrofysiologische, metabolische en moleculaire veranderingen, omvat het hartrijpingsproces de structurele organisatie van sarcomeres, die de fundamentele eenheden zijn die nodig zijn voor krachtgeneratie en celcontractie7. Terwijl volwassen CMs een goed georganiseerd contractielapparaat vertonen, tonen door iPSC afgeleide CMs vaak ongeregelde sarcomerefilamenten aan, geassocieerd met een verminderd contractievermogen en veranderde contractiedynamiek8,9. In tegenstelling tot volwassen CM die eenaxial contractiepatroon vertonen, resulteren de gedesoriënteerde structuren in onrijpe CM in een radiale samentrekking van de hele cel of bevorderen de verschijning van contractie focal points9,10.
Voor het verbeteren van de hartrijping zijn meerdere benaderingen toegepast, waaronder 3D-celkweekmethoden, elektrische en mechanische stimulatie, evenals het gebruik van extracellulaire matrices die in vivo omstandigheden11,12,13nabootsen . Om het succes en de efficiëntie van deze verschillende cultuuromstandigheden te evalueren, zijn technieken nodig om de mate van structurele rijping van iPSC CM te monitoren en te schatten, bijvoorbeeld door middel van microscopische technieken. In tegenstelling tot conventionele confocale beeldvorming is de resolutie in het geval van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) ongeveer 10x hoger. Deze techniek op zijn beurt zorgt voor een meer nauwkeurige analyse, het detecteren van zelfs subtiele veranderingen van cellulaire structuren14. Gezien de hoge resolutie van PALM-gebaseerde beeldvorming, het algemene doel van deze methode was de microscopische evaluatie van sarcomere rijpheid in iPSC-afgeleide CMs door nauwkeurige bepaling van z-Disc dikte en sarcomere lengte. In eerdere studies is aangetoond dat deze structurele kenmerken geschikte parameters zijn om cardiale rijpheid te beoordelen15. Bijvoorbeeld, zieke iPSC-CM ontbreekt volledige lengte dystrophin vertonen verminderde sarcomere lengte en z-band breedte in vergelijking met wilde type cellen16. Ook werd de lengte van individuele sarcomeres gemeten om de impact van topografische signalen op cardiale ontwikkeling16te onderzoeken. Daarom hebben we deze aanpak toegepast om de structurele rijping van het sarcomere-netwerk in iPSC-CM te evalueren door de sarcomerelengte en z-discdikte kwantitatief te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De generatie van functionele iPSC-afgeleide CM in vitro is belangrijk voor regeneratieve therapieën, ziektemodellering en de ontwikkeling van drugscreeningplatforms. Echter, onvoldoende rijpheid van deze CM is een groot obstakel in cardiovasculair onderzoek20. In dit verband zijn beeldvormingstechnieken met hoge resolutie nodig die het mogelijk maken de structurele rijpingstoestand van iPSC-afgeleide CM te monitoren. Tegelijkertijd kan microscopie met superresolutie een waardevol hulpmiddel zijn …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het Structuurfonds van de EU (ESF/14-BM-A55-0024/18). Daarnaast wordt H.L. ondersteund door het FORUN Programma van het Rostock Universitair Medisch Centrum (889001 en 889003) en de Josef and Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. wordt ondersteund door het Clinician Scientist Program van het Rostock University Medical Center. R.D wordt ondersteund door de DFG (DA1296/6-1), de DAMP foundation, de Duitse Hartstichting (F/01/12) en de BMBF (VIP+ 00240).
Wij danken Madeleine Bartsch voor haar technische ondersteuning in de iPSC celcultuur en hartdifferentiatie.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
Riferimenti
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. , (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
