Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi
Summary
Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.
Abstract
iPSC türetilmiş kardiyomiyositlerin olgunlaşması rejeneratif tedavi, ilaç testi ve hastalık modelleme uygulamaları için kritik bir konudur. Birden fazla farklılaşma protokolünün geliştirilmesine rağmen, yetişkin benzeri fenotipi andıran iPSC kardiyomiyositlerin üretimi zorlu olmaya devam etmektedir. Kardiyomiyosit olgunlaşmasının önemli bir yönü, yüksek daralma kapasitesini sağlamak için iyi organize edilmiş bir sarcomere ağının oluşmasını içerir. Burada kardiyomiyositlerde α-aktinin ağının yarı kantitatif analizi için süper çözünürlük tabanlı bir yaklaşım salıyoruz. Fotoaktil lokalizasyon mikroskopisi kullanılarak iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin ve yenidoğan dokusundan izole edilen kardiyak hücrelerin sarkokan uzunluğu ve z-disk kalınlığı karşılaştırması yapıldı. Aynı zamanda, güvenilir veri elde etmek için uygun görüntüleme koşullarının önemini de gösteriyoruz. Sonuçlarımız, bu yöntemin yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip kardiyak hücrelerin yapısal olgunluğunu kantitatif olarak izlemek için uygun olduğunu ve sarcomere organizasyonunun ince değişikliklerinin bile saptanmasını sağladığını göstermektedir.
Introduction
Miyokard enfarktüsü veya kardiyomiyopati gibi kardiyovasküler hastalıklar (KVD) batı dünyasında önemli ölüm nedeni olmaya devam etmektedir1. İnsan kalbi sadece kötü rejeneratif kapasiteye sahip olduğundan, CVD’lerden iyileşmeyi teşvik etmek için stratejilere ihtiyaç vardır. Bu kayıp kardiyomiyositler doldurmak için hücre replasman tedavileri içerir (CM), yanı sıra verimli ve güvenli farmasötik müdahale için yeni anti-aritmik ilaçların geliştirilmesi. Indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) insan CM in vitro sınırsız nesil için umut verici bir hücre kaynağı olduğu gösterilmiştir, rejeneratif tedaviler için uygun, hastalık modelleme, ve ilaç tarama tahlilleri gelişimi için2,3,4.
Birçok farklı kardiyak farklılaşma protokolleri mevcut olmasına rağmen, iPSC kaynaklı CM hala in vitro ve in vivo uygulama5,,6engel bazı fenotipik ve fonksiyonel yönleri eksikliği . Elektrofizyolojik, metabolik ve moleküler değişikliklerin yanı sıra, kardiyak olgunlaşma süreci sarcomeres yapısal organizasyon içerir, hangi kuvvet üretimi ve hücre daralması için gerekli temel birimleri olan7. Yetişkin CM’ler iyi organize edilmiş bir kontraktil cihaz sergilerken, iPSC kaynaklı CM’ler genellikle azaltılmış kasılma yeteneği ve değiştirilmiş daralma dinamikleri ile ilişkili, düzensiz sarcomere filamentler göstermek8,9. Tek eksenli kasılma deseni gösteren olgun CM aksine, olgunlaşmamış CM içinde şaşırmış yapılar tüm hücrenin radyal daralma sonuçları veya daralma odak noktaları nın görünümünü teşvik9,10.
Kardiyak olgunlaşmageliştirmek için, birden fazla yaklaşımlar uygulanmıştır, 3D hücre kültürü yöntemleri de dahil olmak üzere, elektrik ve mekanik stimülasyon, yanı sıra vivo koşullarda taklit hücre dışı matriskullanımı11,12,13. Bu farklı kültür koşullarının başarısını ve verimliliğini değerlendirmek için, iPSC CM’nin yapısal olgunlaşma derecesini mikroskobik teknikler ile izlemek ve tahmin etmek için tekniklere ihtiyaç vardır. Konvansiyonel konfokal görüntülemenin aksine fotoaktik lokalizasyon mikroskobu (PALM) durumunda çözünürlük yaklaşık 10 kat daha yüksektir. Sırayla bu teknik daha doğru bir analiz sağlar, hücresel yapıların bile ince değişiklikler tespit14. PALM tabanlı görüntülemenin yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, bu yöntemin genel amacı, iPSC kaynaklı CM’lerde z-Disk kalınlığı ve sarcomere uzunluğunun kesin olarak belirlenmesi ile sarcomere olgunluğunun mikroskobik değerlendirilmesidir. Daha önceki çalışmalarda, bu yapısal özellikleri kardiyak olgunluk değerlendirmek için uygun parametreler olduğu gösterilmiştir15. Örneğin, hastalıklı iPSC-CM tam uzunlukta distrofin sergileyen vahşi tip hücrelere göre sarcomere uzunluğu ve z-bant genişliği azaltılmış16. Aynı şekilde, bireysel sarcomeres uzunluğu kardiyak gelişim16üzerinde topografik ipuçları etkisini araştırmak için ölçüldü. Bu nedenle bu yaklaşımı, sarcomere uzunluğu ve z-disk kalınlığını nicel olarak ölçerek iPSC-CM’deki sarcomere ağının yapısal olgunlaşmasını değerlendirmek için uyguladık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fonksiyonel iPSC türetilmiş CM in vitro üretimi rejeneratif tedaviler, hastalık modelleme ve ilaç tarama platformlarının geliştirilmesi için önemlidir. Ancak, bu CM yetersiz olgunluk kardiyovasküler araştırma önemli bir engeldir20. Bu bağlamda, iPSC kaynaklı CM’nin yapısal olgunlaşma durumunun izlenmesini sağlayacak yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerine ihtiyaç vardır. Aynı zamanda, süper çözünürlüklü mikroskopi tam olarak belirli proteinlerin işlevin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma AB Yapısal Fonu (ESF/14-BM-A55-0024/18) tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, H.L. Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi FORUN Programı (889001 ve 889003) ve Josef ve Käthe Klinz Vakfı (T319/29737/2017) tarafından desteklenir. C.I.L. Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi’nin Klinisyen Bilim Adamı Programı tarafından desteklenir. R.D DFG (DA1296/6-1), DAMP vakfı, Alman Kalp Vakfı (F/01/12) ve BMBF (VIP+ 00240) tarafından desteklenir.
Madeleine Bartsch’a iPSC hücre kültürü ve kardiyak farklılaşmadaki teknik desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
Riferimenti
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. , (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
