Анализ сети α-Актинин в кардиомиоцитах, полученных человеком iPSC, с использованием микроскопии локализации одной молекулы

Summary

Формирование правильной саркомерной сети имеет важное значение для созревания кардиомиоцитов, полученных из iPSC. Мы представляем супер резолюции на основе подхода, который позволяет для количественной оценки структурного созревания стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов, для улучшения культурных условий содействия развитию сердца.

Abstract

Созревание кардиомиоцитов, полученных из iPSC, является важнейшей проблемой для их применения в регенеративной терапии, тестировании на наркотики и моделировании заболеваний. Несмотря на разработку нескольких протоколов дифференциации, генерация кардиомиоцитов iPSC, напоминающих взрослый фенотип, остается сложной задачей. Одним из основных аспектов созревания кардиомиоцитов является формирование хорошо организованной сети саркомеров для обеспечения высокой мощности сжатия. Здесь мы представляем супер резолюции на основе подхода для полуколиченого анализа α в кардиомиоцитов. С помощью фотоактивированной микроскопии локализации проводилось сравнение длины саркомера и толщины z-диска кардиомиоцитов, полученных из iPSC, и сердечных клеток, изолированных от неонатальной ткани. В то же время мы демонстрируем важность надлежащих условий визуализации для получения достоверных данных. Наши результаты показывают, что этот метод подходит для количественного мониторинга структурной зрелости сердечных клеток с высоким пространственным разрешением, что позволяет выявлять даже тонкие изменения саркомерной организации.

Introduction

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), такие как инфаркт миокарда или кардиомиопатия остаются основной причиной смерти в западном мире¹. Поскольку человеческое сердце обладает лишь плохими регенеративными возможностями, существует необходимость в стратегиях содействия восстановлению после ССЗ. Это включает в себя заместительную терапию клеток для пополнения потерянных кардиомиоцитов (СМ), а также разработку новых антиаритмических препаратов для эффективного и безопасного фармацевтического вмешательства. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) были показаны, чтобы быть перспективным источником клеток для неограниченного поколения человека CM in vitro, подходит для регенеративной терапии, моделирования заболеваний, а также для развития скрининга наркотиков^{анализы 2,3,4}.

Хотя существует много различных протоколов сердечной дифференциации, сМ, полученных iPSC, по-прежнему не имеют определенных фенотипических и функциональных аспектов, которые препятствуют in vitro и in vivo application^5,,6. Помимо электрофизиологических, метаболических и молекулярных изменений, процесс созревания сердца включает в себя структурную организацию сармеров, которые являются основными единицами, необходимыми для генерации силы и^{сокращения клеток 7}. В то время как взрослые CMs демонстрируют хорошо организованный контрактильный аппарат, СМ, полученные iPSC, обычно демонстрируют несовершенные саркомерные нити, связанные с пониженной способностью сжатия и измененной^{динамикой сокращения 8,9}. В отличие от зрелых CM, которые показывают одноосную модель сокращения, дезориентированные структуры в незрелых CM приводит к радиальной сокращения всей клетки или способствовать появлению сокращения^{координационных центров 9,10}.

Для улучшения созревания сердца, несколько подходов были применены, в том числе методы культуры 3D клеток, электрической и механической стимуляции, а также использование внеклеточных матриц имитирующих в условиях Виво^11,12,13. Для оценки успеха и эффективности этих различных культурных условий необходимы методы мониторинга и оценки степени структурного созревания iPSC CM, например, с помощью микроскопических методов. В отличие от обычных конфокальных изображений, разрешение в случае фотоактивированной микроскопии локализации (PALM) примерно в 10 раз выше. Этот метод, в свою очередь, позволяет более точный анализ, обнаруживая даже тонкие изменения клеточных структур¹⁴. Учитывая высокое разрешение изображений на основе PALM, общей целью этого метода была микроскопическая оценка зрелости саркомера в CMs, полученных iPSC, путем точного определения толщины z-Disc и длины саркомера. В предыдущих исследованиях, эти структурные особенности были показаны, чтобы быть подходящими параметрами для оценки сердечной^{зрелости 15}. Например, больные iPSC-CM не хватает полной длины дистрофина экспонат снижение длины саркомера и z-диапазон ширина по сравнению с дикими^{клетками типа 16}. Аналогичным образом, длина отдельных сармеров была измерена для исследования влияния топографических сигналов на развитие сердца¹⁶. Поэтому мы применили этот подход для оценки структурного созревания саркомерной сети в iPSC-CM путем количественного измерения длины саркомера и толщины z-диска.

Protocol

Все этапы этого протокола с участием неонатальных и взрослых мышей были выполнены в соответствии с этическими принципами по уходу за животными Медицинского центра Ростокского университета. 1. Культивирование и диссоциация кардиомиоцитов, полученных из iPSC Диффере?…

Representative Results

Для оценки степени структурного созревания СМ, неонатальный, полностью зрелый взрослый, и iPSC CM были первоначально помечены CM с α-актинин антитела для визуализации саркомерной сети. После приобретения PALM изображения были реконструированы, а толщина z-диска была измерена с помощью прогр?…

Discussion

Поколение функциональных сМ в пробирке, полученных из iPSC, имеет важное значение для регенеративной терапии, моделирования заболеваний и разработки платформ скрининга лекарственных средств. Тем не менее, недостаточная зрелость этих СМ является основным препятствием в сердечно-сосуди?…

Materials

human iPSC cell line	Takara	Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	ibidi	80827
0.5ml eppendorf tube	Eppendorf	30121023
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit	Stem Cell Technologies	05025
Catalase	Sigma Aldrich	C40-1G
Cyclooctatetraene	Sigma Aldrich	138924-1G
Cysteamine	Sigma Aldrich	30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Paraformaldehyde	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53]	Abcam	ab9465
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653
sterile water	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689