Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame
Summary
Descriviamo le procedure per l’isolamento degli ovociti di crescita dai follicoli ovaiosi nelle prime fasi di sviluppo, nonché l’installazione di un sistema di coltura in vitro in grado di sostenere la crescita e la differenziazione fino allo stadio completamente cresciuto.
Abstract
La riserva limitata di oociti maturi e fertilizzanti rappresenta una grande barriera per il successo della riproduzione assistita nei mammiferi. Considerando che durante la durata della vita riproduttiva solo circa l’1% degli ovociti in un ovaio maturo e ovulato, sono state sviluppate diverse tecniche per aumentare lo sfruttamento della riserva ovarica alla crescente popolazione di follicoli non ovulatori. Tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, il vasto potenziale della riserva ovarica è ancora in gran parte non sfruttato. Nelle mucche, ad esempio, sono stati fatti alcuni tentativi di sostenere la coltura in vitro degli ociociti in fasi di sviluppo specifiche, ma non sono ancora stati sviluppati protocolli efficienti e affidabili. Qui descriviamo un sistema di coltura che riproduce le condizioni fisiologiche del corrispondente stadio follicolare, definito per sviluppare ovociti di crescita in vitro raccolti dai follicoli antrali primi bovini allo stadio completamente cresciuto, corrispondente al follicolo antralco medio in vivo. Una combinazione di ormoni e un inibitore fosfodiesterase 3 è stato utilizzato per prevenire la ripresa meiotica intempestivo e per guidare la differenziazione degli ovociti.
Introduction
Durante la durata della vita riproduttiva, solo una frazione minima degli oociti che sono presenti in un maturo ovarico, vengono rilasciati nelle tube di Falloppio dopo l’ovulazione e sono disponibili per essere fecondati e svilupparsi in un embrionevitale 1. D’altra parte, la maggior parte degli oociti all’interno di un’ovaia subiscono atresia e non sono mai ovulati. Le tecnologie di produzione di embrioni in vitro (IVP) hanno tentato di aumentare lo sfruttamento della riservaovarica 2,3. Finora, tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli utilizza oociti che hanno fondamentalmente completato la fase di crescita all’interno del follicolo ovarico astrale, e quindi sono indicati come oociti completamente cresciuti. Nei bovini, dove le tecnologie IVP sono ampiamente utilizzate, gli ovociti completamente cresciuti raggiungono un diametro finale di circa 120 m e vengono raccolti da follicoli che si estendono da 2 a 8 mm di diametro (follicoli antrali medi)1. Dopo l’isolamento dai follicoli, tali oociti sono in vitro maturati e fecondati. Gli zigoti vengono poi rilaccati fino alla fase di blastocisti e trasferiti in un destinatario o crioconservati. Nel bestiame, così come in molte altre specie, nonostante il potenziale offerto dall’IVP, il numero di embrioni prodotti in vitro per mucca non è migliorato in gran parte negli ultimi 40 anni. Ciò è in parte dovuto al numero limitato di ovociti completamente cresciuti che popolano un’ovaia in un dato momento che può essere recuperata e sottoposta a tecniche IVP standard4,5,6.
Gli ovociti racchiusi all’interno dei primi follicoli antrali, cioè quei follicoli di diametro inferiore a 2 mm, rappresentano una potenziale fonte da utilizzare nei programmi di conservazione dellafertilità 7 , poiché un’ovaia contiene approssimativamente 10 volte più follicoli antrali precoci rispetto al medio antral8. Tuttavia, questi oociti sono ancora in fase di crescita e non hanno ancora raggiunto la fase9completamente cresciuta . Come tale, sono ancora trascrizionalmente attivi, producendo mRNA che saranno conservati per fasi successive di sviluppo, e non hanno ancora subito tutto il processo di differenziazione necessario per conferire agli ovociti la capacità di riprendere e completare spontaneamente la meiosi che una volta isolato dal compartimento follicolare10,11. Pertanto, non possono essere sottoposti direttamente ai protocolli standard di maturazione in vitro (IVM), ma richiedono un ulteriore periodo di coltura che permetta loro di completare la fase di crescita e differenziare correttamente.
La transizione dallo stadio di crescita a quello completamente cresciuto, che nel bestiame si verifica quando il follicolo si sviluppa dallo stadio astrale iniziale allo stadio astrale medio, è uno dei passaggi critici durante lo sviluppo degli ovociti. Nel bestiame, diversi studi hanno tentato di ricapitolare questi eventi in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Tuttavia, ad oggi non sono stati sviluppati protocolli affidabili e sono stati segnalati solo un successo limitato. Secondo gli studi precedenti20, questi ovociti in crescita costituiscono una popolazione omogenea. Oltre ad essere trascrizionalmente attivo, la loro cromatina è dispersa nel vescicolo germino (GV), in una configurazione denominata GV02,21. Al contrario, la popolazione di oociti completamente cresciuti ottenuti da follicoli antrali medi è più eterogenea, una condizione che si riflette con i vari gradi di compattazione della cromatina (GV1, GV2 e GV3) che possono essere osservati20. Tra questi, i dati precedenti hanno dimostrato che gli oociti GV2 e GV3 sono complessivamente caratterizzati da una migliore qualità e una maggiore competenza dello sviluppoembrionale 20,21,22,23,24.
A partire dalle osservazioni di cui sopra, qui descriviamo un sistema di coltura di 5 giorni di ovociti (L-IVCO) che permette la differenziazione degli ovociti isolati come complessi cumuli-oociti (COC) dai primi follicoli astrali. Questa strategia culturale si è evoluta da 10 anni di studi condotti nel nostro laboratorio e affonda le sue radici sulla 24-48 ore di coltura ociocita in vitro precedentemente sviluppata (IVCO)2, sistemi diprematurazione 23,25 e il completamento dello zinco durante la coltura degli oocidi . Una combinazione di ormone stimolante follicolo (FSH) e un inibitore fosfodiesterase-3 (PDE3), in grado di migliorare la comunicazione cumulus-oocita2, prevenire la ripresa meiotica intempese2, e supporto crescita ovocita2 è stato utilizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un sistema culturale per la crescita degli ovociti che promuove lo sviluppo degli ovociti per 5 giorni sostenendone la vitalità e prevenendo la ripresa meiotica. Quest’ultimo aspetto è di estrema importanza per consentire la continua crescita e differenziazione necessaria per conferire all’ovocita la competenza dello sviluppo meiotico ed embrionale2,20, che sarebbe altrimenti bloccata da una ripresa prematura della divisione meiotica.
<p cla…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 e UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
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