牛の初期のアンタル卵胞からの卵母細胞のための体外培養戦略
Summary
開発初期段階で卵巣卵胞から卵母細胞を分離する手順と、完全に成長した段階までの成長と分化をサポートできるインビトロ培養システムのセットアップについて説明する。
Abstract
成熟した肥沃な卵母細胞の限られた予備は、哺乳類における補助生殖の成功のための主要な障壁を表す。生殖寿命期間中、卵巣成熟および排卵体の卵母細胞の約1%しか存在しない場合、卵巣予備の利用を非排卵卵胞の増加集団に増加させるいくつかの技術が開発されてきた。このような技術は、不妊治療の保存、家畜の選択プログラム、および絶滅危惧種の保全の介入を可能にしました。しかし、卵巣予備軍の広大な可能性はまだほとんど利用されていない。例えば、牛では、特定の発達段階で卵母細胞の体外培養をサポートするいくつかの試みがなされているが、効率的で信頼性の高いプロトコルはまだ開発されていない。ここでは、インビボ中腹葉に対応して、牛初期のアンタル卵胞から完全に成長したステージに集められた生体外成長卵母細胞を開発するために定義された、対応する濾胞期の生理学的条件を再現する培養系について説明する。ホルモンとホスホジエステラーゼ3阻害剤の組み合わせは、タイムリーなmeiotic再開を防ぎ、卵母細胞の分化を導くために使用されました。
Introduction
生殖寿命期間中、卵巣成熟に存在する卵母細胞のほんの一部は、排卵時に卵管内で放出され、受精して生存可能な胚1に発展するために利用可能である。一方、卵巣内の卵母細胞のほとんどは閉鎖を受け、排卵することはありません。インビトロ胚生産(IVP)技術は、卵巣予備軍22、33の搾取を増加させようとしている。これまでのところ、このような技術は、不妊治療の保存、家畜の選択プログラム、および絶滅危惧種の保全の介入を可能にしてきました。それにもかかわらず、ほとんどのプロトコルは、基本的にアンタル卵巣卵胞内の成長段階を完了した卵母細胞を使用し、したがって完全に成長した卵母細胞と呼ばれる。IVP技術が広く使用されている牛では、完全に成長した卵母細胞は約120μmの最終直径に達し、直径2〜8mm(中角毛)1に及ぶ卵胞から採取される。卵胞から分離すると、そのような卵母細胞は体外成熟し、受精する。その後、ジゴテは胚盤胞期まで培養され、レシピエントまたは凍結保存に移される。牛は、他の多くの種だけでなく、IVPによって提供される可能性にもかかわらず、牛1頭当たりのインビトロ産生胚の数は、過去40年間ほとんど改善されなかった。これは、一定の時間に卵巣を取り出し、標準的なIVP,技術4、5、6に供することができる、完全に成長した卵母細胞の数が4限られているためです。56
初期の角包の中に含まれる卵母細胞、すなわち、直径2mm未満の卵胞は、不妊治療保存プログラム7で使用される潜在的な供給源を表し、卵巣は中型角質8よりも約10倍多い初期のアンタル卵胞を含む。しかし、これらの卵母細胞はまだ成長段階にあり、まだ完全に成長した段階9に達していない。したがって、それらはまだ転写活性であり、後の発達段階のために保存されるmRNAを産生し、そして私がかつて濾胞室10、11,11から隔離された明視を自発的に再開して完了させる能力を母細胞に与えるために必要なすべての分化プロセスをまだ受けていない。したがって、標準の in vitro 成熟 (IVM) プロトコルに直接提出することはできませんが、成長フェーズを完了し、適切に区別できる追加の培養期間が必要です。
成長から完全に成長した段階への移行は、牛で卵胞が初期の角質から中型の角質段階に発達したときに起こる、卵母細胞の発達中の重要なステップの一つである。牛では、いくつかの研究は、vitro,,2、12、13、14、15、16、17、18、1912,13,14,15,16でこれらの出来事18を19再現しようとしました。217しかし、現在までに信頼性の高いプロトコルは開発されておらず、限られた成功しか報告されていません。これまでの研究20によると、これらの成長する卵母細胞は均質な集団を構成する。転写活性であることに加えて、それらのクロマチンは、GV0,2,21という名前の構成で、胚性小胞(GV)に分散される。21逆に、中型の卵胞から得られる完全に成長した卵母細胞の集団は、より不均一であり、クロマチン圧縮の様々な程度(GV1、GV2およびGV3)によってミラーリングされる状態である20を観察することができる。これらの中で、以前のデータは、GV2およびGV3卵母細胞がより良い品質およびより高い胚発生能力20、21、22、23、24によって全体的に特徴付けられることを示している。20,21,22,23,24
上記の観察から始めて、初期の角胞から積雲卵母細胞複合体(COC)として分離された卵母細胞の分化を可能にする卵母細胞(L-IVCO)の5日間の長い培養システムについて説明する。この文化戦略は、私たちの研究室で行われた10年の長い研究から進化し、以前に開発された24-48時間の体外卵母細胞培養(IVCO)2、卵母細胞培養中の準備システム23、25および25卵子培養中の亜鉛補充に基づいて根付いています。卵胞刺激ホルモン(FSH)とホスホジエステラーゼ-3(PDE3)阻害剤の組み合わせにより、積雲-卵母細胞通信2を増強することができ、不時の起血再開2を防止し、かつ支持卵母細胞成長2を使用した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、卵母細胞の生存率をサポートし、そして、meiotic再開を防止することによって、5日間の卵母細胞の発達を促進する培養システムについて説明する。この後者の側面は、大腸分裂の早期再開によって妨げられる、大腸および胚発生能力22、2020と卵母細胞を与えるために必要な継続的な成長と分化を可能にするために最も重要である。
<p c…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、リージョンロンバルディア PSR INNOVA n.201801061529 および UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01によってサポートされました。
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
Riferimenti
- Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
