Estratégia de Cultura In Vitro para Oócitos do Folículo Antral Primitivo em Bovinos
Summary
Descrevemos os procedimentos para o isolamento dos oócitos em crescimento dos folículos ovarianos nos estágios iniciais de desenvolvimento, bem como a criação de um sistema de cultura in vitro que possa apoiar o crescimento e a diferenciação até o estágio totalmente crescido.
Abstract
A reserva limitada de oócitos maduros e fertilizantes representa uma grande barreira para o sucesso da reprodução assistida em mamíferos. Considerando que durante a vida reprodutiva apenas cerca de 1% dos oócitos em um ovário maduro e ovulado, várias técnicas foram desenvolvidas para aumentar a exploração da reserva ovariana para a crescente população de folículos não ovulatórios. Tais tecnologias permitiram intervenções de preservação da fertilidade, programas de seleção na pecuária e conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, o vasto potencial da reserva ovariana ainda é em grande parte inexplorado. Nas vacas, por exemplo, algumas tentativas foram feitas para apoiar a cultura in vitro de oócitos em estágios específicos de desenvolvimento, mas protocolos eficientes e confiáveis ainda não foram desenvolvidos. Aqui descrevemos um sistema cultural que reproduz as condições fisiológicas do estágio folicular correspondente, definido para desenvolver oócitos in vitro de crescimento coletados de folículos antral bovinos precoces para o estágio totalmente crescido, correspondente ao folículo antral médio in vivo. Uma combinação de hormônios e um inibidor de fosfodiesterase 3 foi usada para evitar a retomada meiotica prematura e para orientar a diferenciação do oócito.
Introduction
Durante a vida reprodutiva, apenas uma fração mínima dos oócitos que estão presentes em um ovário maduro, são liberados nos tubos de falópio após a ovulação, e estão disponíveis para serem fertilizados e se desenvolverem em um embrião viável1. Por outro lado, a maioria dos oócitos dentro de um ovário sofre atresia e nunca são ovulados. As tecnologias de produção de embriões in vitro (IVP) têm tentado aumentar a exploração da reserva ovariana2,3. Até agora, tais tecnologias permitiram intervenções de preservação da fertilidade, programas de seleção na pecuária e conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, a maioria dos protocolos usa oócitos que basicamente completaram a fase de crescimento dentro do folículo ovariano antral, e, portanto, são referidos como oócitos totalmente cultivados. No gado, onde as tecnologias IVP são amplamente utilizadas, os oócitos totalmente cultivados atingem um diâmetro final de aproximadamente 120 μm e são coletados de folículos que se estendem de 2 a 8 mm de diâmetro (folículos antral médios)1. Após o isolamento dos folículos, tais oócitos são in vitro amadurecidos e fertilizados. Os zigotes são então cultivados até o estágio blastocisto e ou transferidos para um destinatário ou criopreservados. No gado, assim como em muitas outras espécies, apesar do potencial oferecido pelo IVP, o número de embriões produzidos in vitro por vaca não melhorou em grande parte nos últimos 40 anos. Isso se deve, em parte, ao número limitado de oócitos totalmente cultivados que povoam um ovário em um determinado momento que pode ser recuperado e submetido às técnicas padrão IVP4,,5,,6.
Os oócitos fechados dentro dos folículos antrais primitivos, ou seja, aqueles folículos com menos de 2 mm de diâmetro, representam uma fonte potencial a ser usada nos programas de preservação da fertilidade7, pois um ovário contém aproximadamente 10 vezes mais folículos antral mais precoces do que os antralmédios 8. No entanto, esses oócitos ainda estão em fase de crescimento e ainda não atingiram o estágio9completo . Como tal, eles ainda estão transcricionalmente ativos, produzindo mRNAs que serão armazenados para etapas posteriores de desenvolvimento, e ainda não passaram por todo o processo de diferenciação necessário para conferir aos oócitos a capacidade de retomar e completar espontaneamente a meiose que uma vez isolei do compartimento folicular10,11. Portanto, eles não podem ser submetidos diretamente a protocolos de maturação in vitro padrão (IVM), mas exigem um período adicional de cultura que lhes permitiria completar a fase de crescimento e diferenciar adequadamente.
A transição do crescimento para o estágio totalmente cultivado, que no gado ocorre quando o folículo se desenvolve desde o início da antral até a fase antral média, é um dos passos críticos durante o desenvolvimento do oócito. No gado, diversos estudos tentaram recapitular esses eventos in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. No entanto, até o momento nenhum protocolo confiável foi desenvolvido e apenas o sucesso limitado foi relatado. De acordo com estudos anteriores20, esses oócitos em crescimento constituem uma população homogênea. Além de ser transcriticamente ativo, sua cromatina é dispersada na vesícula germinal (GV), em uma configuração chamada GV02,21. Por outro lado, a população de oócitos totalmente cultivados obtidos a partir de folículos antrais médios é mais heterogênea, condição espelhada pelos diversos graus de compactação de cromatina (GV1, GV2 e GV3) que podem ser observados20. Entre estes, dados anteriores mostraram que os oócitos GV2 e GV3 são, emgeral,caracterizados por uma melhor qualidade e maior competência de desenvolvimento embrionário20,21,,22,,23,24.
A partir das observações acima, descrevemos aqui um sistema cultural de 5 dias de duração de oócitos (L-IVCO) que permite a diferenciação de oócitos isolados como complexos cumulus-oócitos (COCs) dos folículos antral primitivos. Essa estratégia cultural evoluiu a partir de 10 anos de estudos realizados em nosso laboratório e enraiza seu terreno na cultura oócida in vitro (IVCO)2, sistemas de prematuração23,,25 e suplementação de zinco durante a cultura oócito. Uma combinação de hormônio estimulante folículo (FSH) e um inibidor de fosfodiesterase-3 (PDE3), capaz de melhorar a comunicação cumulus-oocyte2,prevenir a retomada meiotic intempescional2, e apoiar o crescimento do oócito2 foi usado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um sistema cultural para o crescimento de oócitos que promove o desenvolvimento de oócitos por 5 dias, apoiando sua viabilidade e impedindo a retomada do meiotico. Este último aspecto é de extrema importância para permitir o crescimento contínuo e a diferenciação necessários para conferir o oócito com competência de desenvolvimento meiotic e embrionário2,20, que seria bloqueado de outra forma por uma retomada prematura da divisão mei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 e unimi n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
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