Stratégie de culture in vitro pour les ovocytes du follicule antral précoce chez les bovins
Summary
Nous décrivons les procédures d’isolement des ovocytes croissants des follicules ovariens aux premiers stades de développement, ainsi que la configuration d’un système de culture in vitro qui peut soutenir la croissance et la différenciation jusqu’au stade adulte.
Abstract
La réserve limitée d’ovocytes matures et fertilisables représente un obstacle majeur au succès de la procréation assistée chez les mammifères. Considérant que pendant la durée de vie reproductive seulement environ 1% des ovocytes dans un ovaire mature et ovule, plusieurs techniques ont été développées pour augmenter l’exploitation de la réserve ovarienne à la population croissante de follicules non ovulatoires. Ces technologies ont permis des interventions de préservation de la fertilité, de programmes de sélection dans le bétail et de conservation des espèces en voie de disparition. Cependant, le vaste potentiel de la réserve ovarienne est encore largement inexploité. Chez les vaches, par exemple, certaines tentatives ont été faites pour soutenir la culture in vitro des ovocytes à des stades de développement spécifiques, mais des protocoles efficaces et fiables n’ont pas encore été élaborés. Nous décrivons ici un système de culture qui reproduit les conditions physiologiques du stade folliculaire correspondant, défini pour développer des ovocytes de croissance in vitro prélevés à partir de follicules antrals précoces bovins jusqu’au stade adulte, correspondant au follicule antral moyen in vivo. Une combinaison d’hormones et d’un inhibiteur de la phosphodiestérase 3 a été utilisée pour prévenir la reprise méiotique prématurée et pour guider la différenciation des ovocytes.
Introduction
Au cours de la durée de vie reproductive, seule une fraction minimale des ovocytes qui sont présents dans un ovaire mature, sont libérés dans les trompes de Fallope lors de l’ovulation, et sont disponibles pour être fécondés et se développer en un embryon viable1. D’autre part, la plupart des ovocytes dans un ovaire subissent une atrésie et ne sont jamais ovulés. Les technologies de production d’embryons in vitro (IVP) ont tenté d’accroître l’exploitation de la réserve ovarienne2,3. Jusqu’à présent, ces technologies ont permis des interventions de préservation de la fertilité, de programmes de sélection dans le bétail et de conservation des espèces en voie de disparition. Néanmoins, la plupart des protocoles utilisent des ovocytes qui ont essentiellement terminé la phase de croissance dans le follicule ovarien antral, et sont donc appelés ovocytes adultes. Chez les bovins, où les technologies IVP sont largement utilisées, les ovocytes adultes atteignent un diamètre final d’environ 120 μm et sont prélevés dans des follicules qui s’étendent de 2 à 8 mm de diamètre (follicules antrales moyens)1. Après l’isolement des follicules, ces ovocytes sont in vitro mûris et fécondés. Les zygotes sont ensuite cultivés jusqu’au stade blastocyste et soit transférés dans un destinataire ou cryoconservés. Chez les bovins, ainsi que chez de nombreuses autres espèces, malgré le potentiel offert par ivp, le nombre d’embryons produits in vitro par vache ne s’est pas largement amélioré au cours des 40 dernières années. Cela est dû en partie au nombre limité d’ovocytes adultes qui peuplent un ovaire à un moment donné qui peut être récupéré et soumis aux techniques STANDARD IVP4,5,6.
Les ovocytes enfermés dans les follicules antral précoces, c’est-à-dire les follicules de moins de 2 mm de diamètre, représentent une source potentielle à utiliser dans les programmes de préservation de la fertilité7 , car un ovaire contient environ 10 fois plus de follicules antral précoces que les antrales moyens8. Cependant, ces ovocytes sont encore en phase de croissance et n’ont pas encore atteint le stade9. En tant que tels, ils sont encore transcriptionnellement actifs, produisant des ARNms qui seront stockés pour des étapes ultérieures de développement, et n’ont pas encore subi tout le processus de différenciation nécessaire pour conférer les ovocytes avec la capacité de reprendre spontanément et de compléter la méiose I une fois isolé du compartiment folliculaire10,11. Par conséquent, ils ne peuvent pas être soumis directement aux protocoles standard de maturation in vitro (IVM), mais ils nécessitent une période de culture supplémentaire qui leur permettrait de terminer la phase de croissance et de différencier correctement.
La transition de l’étape de la culture à l’étape adulte, qui chez le bétail se produit lorsque le follicule se développe du stade antral précoce au stade antral moyen, est l’une des étapes critiques du développement des ovocytes. Chez le bétail, plusieurs études ont tenté de récapituler ces événements in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Cependant, à ce jour, aucun protocole fiable n’a été élaboré et seul un succès limité a été signalé. Selon des études précédentes20, ces ovocytes croissants constituent une population homogène. En plus d’être transcriptionnellement actives, leur chromatine est dispersée dans la vésicule germinale (GV), dans une configuration qui s’appelle GV02,21. Inversement, la population d’ovocytes adultes obtenus à partir de follicules antral moyens est plus hétérogène, une condition qui se reflète par les différents degrés de compactage de la chromatine (GV1, GV2 et GV3) qui peut être observé20. Parmi ceux-ci, des données antérieures ont montré que les ovocytes GV2 et GV3 sont globalement caractérisés par une meilleure qualité et une meilleure compétence de développement embryonnaire20,21,22,23,24.
À partir des observations ci-dessus, nous décrivons ici un système de culture de 5 jours d’ovocytes (L-IVCO) qui permet la différenciation des ovocytes isolés comme complexes cumulus-oocytes (COC) des follicules antral précoces. Cette stratégie de culture a évolué à partir de 10 ans d’études menées dans notre laboratoire et les racines de son terrain sur les 24-48 heures précédemment développé culture ovocytes (IVCO)2, systèmes de prématuration23,25 et la supplémentation en zinc au cours de la culture des ovocytes . Une combinaison de l’hormone stimulante de follicule (FSH) et d’un inhibiteur de phosphodiestérase-3 (PDE3), capable d’améliorer la communication cumulus-oocyte2, empêchent la reprise méiotique intempestive2, et soutiennent la croissance d’oocyte2 a été employée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un système de culture pour la croissance des ovocytes qui favorise le développement des ovocytes pendant 5 jours en soutenant leur viabilité et en empêchant la reprise méiotique. Ce dernier aspect est de la plus haute importance pour permettre la croissance continue et la différenciation nécessaires pour conférer l’ovocyte avec la compétence méiotique et embryonnaire de développement2,20, qui serait autrement bloqué par une repr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 et UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
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