Summary
该协议提出了一个改进的方法，以获得可吸收的缝合的瞬时心肌肥大，模拟左心室肥大减少后，消除压力过载。它可能对心肌肥大先天性研究很有价值。
Abstract
基于小鼠两次横向主动脉收缩（TACs），证明心肌肥大预后（MHP）可以减轻心肌细胞肥大，减缓心力衰竭的进展。然而，对于新手来说，MHP模型通常很难建立，因为呼吸机操作的技术障碍，反复打开胸部，以及脱体引起的出血。为了促进这种模式，提高手术成功率和减少出血的发生率，我们改用可吸收的缝合线进行第一次TAC梳理，采用无呼吸机技术。使用2周的可吸收缝合，我们证明这个程序可能会导致严重的心肌萎缩在2周：手术后4周，心肌萎缩几乎完全退回到基线。使用此协议，操作员可以轻松掌握 MHP 模型，降低操作死亡率。
Introduction
缺血性先导是一种现象，诱发短暂的非致命性缺血发作和对心脏的再灌注，并有能力显著减少心肌损伤1。鉴于缺血性先决条件的明显临床意义，如限制心肌梗塞大小2和抑制心室心肌梗塞后心肌复明3，已经有很多研究来解剖机制潜在的心防作用诱导的先决条件4，5。相比之下，其他非缺血的先决条件却很少受到关注。心脏肥大可能钝化在主动脉狭窄患者进行主动脉瓣更换6。在存在病理心肌萎缩状态的地方，很少报告先决条件原理。
1991年，罗克曼等人首次建立了通过横向主动脉收缩（TAC）7导致左心室肥大的小鼠模型。通过在小鼠中两次操作TAC，我们先前已经证明心肌肥大预后（MHP）会导致心脏短暂性肥大刺激，从而使心脏在未来8月对持续的肥大压力更具抵抗力。MHP模型的特点已通过超声波生物显微镜和血动力学评估9得到验证。构建模型的要点是执行胸腔切除术三次，TAC 一周，解散一周，二级 TAC 6 周。然而，去组织可能导致出血，这使得新手难以掌握，也难以推广。此外，给小鼠进行管网也是一项技术挑战。不当的受管可能导致气管损伤、肺气管损伤，甚至导致小鼠死亡。因此，在构建MHP模型的同时，改进一些程序是必要和有价值的。
为了降低模型的难度并增加其成功率，我们切换到可吸收的缝合线为第一个TAC，并通过测量压力梯度通过回声心动图10下主动脉收缩监测模型的成功。根据我们的初步实验，在压力梯度过低的小鼠中很难诱发足够的心肌肥大，而压力梯度过高的小鼠会发展成急性心力衰竭甚至死亡。模型的理想压力梯度范围为 40–80 mmHg11。此外，这个实验没有依靠呼吸机，它可以有效地避免呼吸机相关的技术操作和伤害12。
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Protocol
所有程序都是按照美国国家卫生研究院出版的《 实验室动物的护理和使用 指南》进行的（NIH出版物第85-23号，1996年修订）。C57BL/6J雄性小鼠（8~10周，20~25克）由南方医科大学动物中心提供。
1. 术前准备
- 用针架捏掉 25 G 针的尖端，用像支架这样的硬物将其钝化。
- 通过针头传递一个5+0可吸收的缝合线，然后弯曲到90°与持有人13。
注：根据不同的研究目的，研究者可以选择吸收时间不同的可吸收线。在此协议中，我们使用 2 周的可吸收缝合收缩主动脉拱门。 - 将另一根 25 G 针弯曲至 120°，并用支架平滑尖端，用作配扎步骤中的垫片。
注：25 G 针头用作体重 （BW） + 25 g 的小鼠的垫片。使用 26 G 针对小鼠与 19–24 g BW. - 用75%的酒精对手术现场进行消毒。
- 将加热垫温度调整为 37 °C。
- 准备消毒手术器械（包括1把眼科剪刀、1把微剪刀、2把微手术肘钳、1个针架和1个微型针架）。
2. 麻醉和剃须的感应
- 通过在盐溶液中稀释的西拉津（5毫克/千克）和氯胺酮（100毫克/千克）的混合物（0.9%NaCl）进行腹膜注射，使小鼠麻醉。用负踏板戒断反射确认完全麻醉。
- 通过用缝合针固定切口和用胶带固定四肢，使鼠标保持超细位置。
- 涂抹脱毛霜，去除颈部和西福的头发。用碘对该地区进行消毒，然后用75%的酒精消毒。
3. 手术
- 用手术刀在超胸缺口和胸部之间的中线位置切口超过 10 毫米。然后，将皮肤和表面筋膜分开。
- 通过从骨部角度计算肋骨来识别第一个间距空间。在第一个间歇空间中执行切口，并尽可能靠近胸骨。用肘部钳子模糊地穿透它， 打开这个空间。
- 轻轻地将帕奇马和胸腺分开，直到可以看到横向主动脉拱门。
注意：不要损坏胸膜，以避免肺气管。 - 通过主动脉之间的主动脉拱门下的5–0可吸收缝合，用闩锁针14。请确保手术场内可见胸动脉、左侧普通胡萝卜动脉和左下腹动脉。
- 将垫片放在第 1.3 步准备的隔横主动脉上，并在垫片上执行双结，并在第 3.4 步中用缝合线进行。
注意：垫片的尖端必须钝，以避免在取出横向主动脉时损坏它。 - 快速但轻轻地拆下垫片，然后切开缝合线的末端。
- 使用 5–0 尼龙缝合线关闭第一个间歇空间和皮肤。用75%的酒精再次消毒皮肤。
- 将鼠标放在加热垫上，以促进恢复。手术后头3天静脉注射丁丙诺啡（0.1毫克/千克，q12h）。
- 当老鼠恢复知觉时，将鼠标放回笼子，在12小时光/暗循环室中。
- 执行与上述所有步骤相同的虚假手术，但没有收缩（步骤 3.5）。
- 为丝绸缝合组执行手术，与上述所有步骤相同，但在第 1.2 步使用 5–0 丝缝合。
4. 成功配对和测量的回声心电图评估
- 手术后在日（D）7进行心电图评估。
- 麻醉小鼠3%通过吸入吸入感应，1.5%保持麻醉深度，0.5+1 L/分钟氧气流速。
- 将鼠标置于平台上的超平位置，保持在 37 °C，并将四肢贴在电极上。
- 用脱毛霜去除胸毛，在鼠标的胸部涂抹超声波耦合剂。
- 使用 30 MHz 探头评估横向主动脉收缩。
- 将平台向最左边倾斜。将探针保持垂直位置，并沿着右侧栏杆线将其放在胸部。然后，在 B 模式下操纵 X 轴和 Y 轴，直到主动脉拱门清晰可见。
- 通过B模式定位收缩以获得主动脉拱视图11。使用彩色多普勒模式和脉冲波测量峰值流速，并选择速度超过 3，000 mm/s 的小鼠作为 TAC 组（值基于初步实验）。
- 根据伯努利方程11的修改版本计算压力梯度：
压力梯度 =4 x V最大2。
注：横向主动脉收缩模型的理想压力梯度范围为40-80 mmHg11。 - 使用 Cine 商店和帧存储保存数据和图像。
- 使用 30 MHz 探头评估左心室 （LV） 的尺寸和收缩度。
- 将平台重置为水平位置。相对于左侧的抛物线，将探头保持在 30° 逆时针。
- 使用 B 模式并操纵 X 和 Y 以获得清晰而完整的心轴视图。
- 按 M 模式显示指示线。使用 Cine 商店和框架存储获取图像，以以后测量 LV 腔室尺寸、部分缩短和 LV 壁厚度。
- 一旦完成，停止异氟烷吸入，让小鼠从麻醉中恢复过来。然后，将动物送回笼子，在12小时光/暗循环室。
- 在手术后的D14和D28上，重复上述步骤测量心脏参数，然后收获心脏进行组虫学研究。
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Representative Results
在这项研究中，我们随机将45只小鼠分成三组，分别是假象组、丝缝组和可吸收缝合组（TAC之后D0（基线）、D14和D28上每组的数量分别为15、10和5）。手术后的D7、D14、D21和D28，收缩的峰值速度由心电图确定。我们发现，在TAC之后的第二周，收缩处的血流速度仍然大于3，000毫米/秒，即使使用可吸收的缝合线收缩主动脉拱门（图1A）。此外，可吸收缝合组收缩时的压力梯度在2周内维持在40 mmHg以上（图1B）。有趣的是，手术后的第四周没有收缩，这表明可吸收的缝合线已被完全吸收。
我们还发现，末端硅胶的左心室后壁厚度增加，末端隔膜左心室内部直径在TAC（图2A-C）之后的D14上略有下降。有趣的是，可吸收缝合组末端硅胶的左心室后壁厚度在 TAC 之后的 D28 上大幅倒退，与基线水平没有显著差异。此外，使用可吸收的缝合线制作模型不会影响左心室的弹出部分（图2D）。
与假丝缝合组相比，丝绸缝合组和可吸收缝合组的硬件/BW比率增加了30%。在TAC之后的D28上，心肌肥大退步，比例回落到可吸收缝合组的基线水平（图3A），而丝缝组的比例增加了64%。H&E染色的结果也支持心脏肥大（图3B）。总之，可吸收缝合适合引起瞬态病理肥大刺激，符合心肌肥大预制模型的要求。
定量数据被作为平均± SD 呈现。假缝、丝缝和可吸收缝合之间的比较是使用单向 ANOVA 进行的， 然后是邦费罗尼的事后比较。
图1：脉冲波多普勒成像和收缩的峰值速度和压力梯度的结果。在 D0 （基线）， D7， D14， D21 和 D28 后 TAC 使用丝绸缝合或可吸收的缝合， 主动脉拱门或收缩由脉冲波多普勒测量.（A） 丝绸缝合组和可吸收缝合组手术后D0（基线）、D14和D28峰值速度的代表成像。可吸收缝合组的血流速度恢复到基线，而手术后D28的丝缝组的血流速度仍大于3，000毫米/s。（B） 压力梯度是根据修改后的 Bernoulli 方程计算的：压力梯度 = 4 x V最大2 （V= 最大峰值速度）。*：p&0.05与假。#：p&0.05与丝绸缝合组（D0（基线）、D14和D28上每个组的数量分别为15、10和5）。作为平均± SD 呈现的数据。 请单击此处查看此图的更大版本。
图2：结构和收缩功能的左心室参数。（A） 从丝绸缝合组的左心室 （LV） 和 TAC 后 D0 （基线）、 D14 和 D28 上的可吸收缝合组进行 M 模式成像。在丝缝合组中，LV壁厚度在末端焦油的代表性图像约为 0.70 mm （D0） 至 1.089 mm （D28）。至于可吸收的缝合组，壁厚约为0.658毫米（D28），几乎返回基线。（B） 左心室后壁厚度在末端硅胶 （LVPWd）。（C） 左心室内部直径在末端硅胶 （LVIDD）。（D） 左心室弹出分数 （EF）。*：p&0.05与假同时（D0（基线）、D14和D28上每个组的数量分别为15、10和5）。作为平均± SD 呈现的数据。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3：心肌肥大预后模型中的可逆心脏肥大。（A） 心脏重量 （HW） 与体重 （BW） 比率。（B） 带有 H&E 染色的心脏组织切片（比例杆 = 50μm）。丝缝合组的心肌细胞从D14显著扩大至D28，而可吸收缝合组的细胞大小大多在D28上退步。*：p&0.05与假同时（D0（基线）、D14和D28上每个组的数量分别为15、10和5）。作为平均± SD 呈现的数据。 请单击此处查看此图的更大版本。
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Discussion
在心脏非缺血预科中，仍然存在着一个大大不足的区域。根据我们以前的研究，我们改用可吸收的缝合线来改善心肌肥大预后模式。
在先前的报告中，许多调查人员使用丝绸缝合来收缩主动脉拱门8号、14号、15号。丝绸缝合很容易获得，经常用于手术伤口缝合，组织结块和组织固定。在此协议中，我们用可吸收的缝合替换了第一个 TAC 的丝绸缝合线。我们发现收缩中的血流速度仍然达到3000毫米/s或更多，持续了2周，这足以作为一种长期的肥大刺激。然后，它将返回到 D28 的基线。然而，很难控制可吸收缝合物的吸收时间。吸收时间与材料和一批可吸收的缝合、组织的适应性和收缩时的紧绷性有关。我们之前发现收缩越紧，吸收时间越少，但与此同时，老鼠的死亡率也会增加。因此，我们选择峰值速度在3000毫米/s左右作为标准，以便吸收时间可以在2周内得到控制，小鼠的存活率也可以提高。更重要的是，使用可吸收的缝合可以将开胸时间缩短到两次，从而降低手术难度，提高模型的成功率。
手术期间，小鼠的生命支持通常需要呼吸机。据报道，大鼠主动脉拱门可以收缩没有呼吸机使用超强的fossa方法15。然而，这需要削减小鼠的胸骨，这可能延长手术恢复时间。在这项研究中，我们选择了这种方法：收缩第一个靠近胸骨的间歇空间，进行手术。这是一个微创的方法，通过横向胸腔切除术14。令人惊讶的是，如果切口离胸骨尽可能近，我们可以在没有呼吸机的情况下执行 TAC。这种方法还可以有效地避免呼吸机相关的技术操作和伤害12。此外，通过切口进入小鼠的中间，主动脉拱门被清楚地暴露出来，因为手术领域几乎没有对胸腺组织和其他血管的干扰。
虽然在整个操作过程中不使用呼吸机是很方便的，但改进后的方法仍然具有因胸膜损伤引起的肺气管损伤的风险。有一些建议，这可能是有用的，以避免损害胸花。尽可能把针尖打钝。进入介质后，在整个操作过程中尽可能保持肘部钳尖的垂直。在连体过程中，将垫片沿前中线放入介质中。
总之，我们改进了使用可吸收缝合物进行心肌肥大和回归的小鼠模型，在建立心肌肥大先决条件模型、探索肥大退行机制、研究左心室可逆改造时间等方面具有许多潜在的应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（81770271：给Y，廖），中国国家自然科学基金联合基金（U1908205：给Y，廖）和广州市科技规划项目（201804020083：廖博士）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
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